La modulació de la via de senyalització del receptor d'hidrocarburs aril impacta en la replicació del virus Junín Part 1

Resum:

El virus Junín (JUNV), membre de la família Arenaviridae, és l'agent etiològic de la febre hemorràgica argentina, una malaltia endèmica a la regió rural argentina sense quimioteràpia específica. El receptor d'hidrocarburs arílics (AHR) s'expressa en diversos teixits de mamífers i s'ha indicat com a sensor de lligands de fonts variables i modulador de la resposta immune cel·lular.

El virus Junin és un virus rar que afecta el sistema immunitari humà i provoca una resposta immune severa. Tanmateix, la immunitat no és l'única estratègia que no aconsegueix combatre el virus Junin.

En primer lloc, descansar i dormir prou és important per mantenir el vostre sistema immunitari saludable. Durant el son, el cos allibera substàncies anomenades citocines que ajuden al sistema immunitari a respondre amb més eficàcia als virus i altres amenaces externes.

En segon lloc, els hàbits alimentaris saludables també són la clau per millorar la immunitat. Menjar aliments rics en vitamines C i D, com els cítrics i els bolets, pot ajudar a augmentar la resposta immune del cos.

A més, l'exercici moderat també pot millorar la immunitat. L'exercici adequat pot augmentar el nombre de glòbuls blancs al cos, millorant així la capacitat del sistema immunitari.

Finalment, un bon estat mental també és molt important per a la salut del sistema immunitari. L'estrès i l'ansietat poden afectar la resposta immune del cos, per la qual cosa és important mantenir-se relaxat i positiu.

En definitiva, tot i que el virus Junin té un impacte en el sistema immunitari, millorant el nostre estil de vida i mantenint una actitud positiva, podem millorar la nostra immunitat i prevenir i respondre eficaçment als atacs de virus. Des d'aquest punt de vista, hem de millorar la nostra immunitat. Cistanche pot millorar significativament la immunitat, perquè la cendra de carn conté una varietat de components biològicament actius, com ara polisacàrids, dos bolets, Huang Li, etc. Aquests components poden estimular el sistema immunitari. Diversos tipus de cèl·lules del sistema augmenten la seva activitat immune.

Feu clic al suplement cistanche deserticola

Curiosament, estudis recents han suggerit que l'activació o la depressió de la via de senyalització AHR pot tenir un paper en el resultat de diverses infeccions víriques humanes. En el present informe, es va analitzar l'efecte de la modulació farmacològica de l'AHR sobre la infecció in vitro de JUNV. Un cribratge inicial de microarrays va mostrar que la via AHR estava sobreexpressada a les cèl·lules hepàtiques infectades amb JUNV.

Simultàniament, la infecció de les cèl·lules Vero i Huh-7 amb les soques JUNV IV4454 i Candid#1 es va inhibir significativament de manera dependent de la dosi mitjançant el tractament amb CH223191, un antagonista específic de l'AHR, tal com es va detectar mitjançant assajos d'infectivitat, real- RT-PCR en temps i detecció per immunofluorescència de proteïnes virals. A més, el paper pro-viral de l'AHR en la infecció per JUNV sembla ser independent de la via IFN-I. Els nostres resultats donen suport a les perspectives prometedores de la modulació farmacològica de l'AHR com a objectiu potencial per al control de l'AHF.

Paraules clau:

receptor d'hidrocarburs aril; virus Junín; arenavirus; febre hemorràgica argentina; diana terapèutica de l'hoste.

1. Introducció

Actualment, hi ha evidència creixent que recolza que el receptor d'hidrocarburs aril (AHR) és un modulador important de la resposta immune de l'hoste i aquesta característica contribueix als resultats clínics diferencials de les infeccions a nivell individual i poblacional [1,2]. L'AHR és un receptor citoplasmàtic expressat de manera ubiqua en els teixits dels mamífers, que funciona com a sensor d'una gran varietat de lligands endògens i exògens amb diferents orígens, com ara contaminants, dieta, microbioma i metabolisme de l'hoste [3–5].

De fet, s'ha suggerit fermament que l'AHR té un impacte important en la interacció entre els factors ambientals i les infeccions víriques [1,2]. Una vegada que l'AHR reconeix una molècula de lligand, es trasllada al nucli on s'heterodimeritza amb el translocador nuclear del receptor d'hidrocarburs aril i regula l'expressió dels gens del metabolisme xenobiòtic (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1).

L'AHR també pot interactuar amb altres factors de transcripció, com ara NF-kB, per modular una àmplia gamma de vies de senyalització, incloses les implicades en la resposta immune [6–8]. L'AHR pot modular l'expressió de gens immunoreguladors i alterar les vies de diferenciació de les cèl·lules dendrítiques inflamatòries i les cèl·lules T [9–11].

Estudis recents realitzats pel nostre grup de recerca han demostrat que l'activació de la via de senyalització de l'AHR té un paper pro-viral durant el Zika (ZIKV), el dengue (DENV) [12] i la síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2 (SARS-CoV{{{{). 4}}) infeccions [13]. Tingueu en compte que es va confirmar que la inhibició de l'AHR va provocar una disminució de la replicació viral en aquests models virals, demostrant que l'AHR representa una estratègia antiviral prometedora.

El virus Junín (JUNV) és un virus del genoma d'ARN segmentat amb embolcall de la família Arenaviridae [14]. Cada segment d'ARN codifica per dues proteïnes en direccions oposades. D'una banda, el segment gran (ARN L) codifica per a l'ARN polimerasa depenent de l'ARN (L) i la proteïna de la matriu (Z).

D'altra banda, el segment petit (ARN S) codifica per a la nucleoproteïna (NP) i el precursor de la glicoproteïna (GPC), que és escindida per proteases per produir tres subunitats (GP1, GP2 i el pèptid senyal SSP) que són s'uneixen per formar el complex de glicoproteïnes [14].

La JUNV és l'agent etiològic de la febre hemorràgica argentina (FAH) [15], una malaltia endèmica que afecta la població de treballadors rurals a la regió humida de la Pampa argentina. Tingueu en compte que un tret característic de l'AHF és l'ampli ventall de símptomes clínics que presenten els pacients infectats. La malaltia asimptomàtica o lleu, amb símptomes semblants a la grip, es produeix en el 70-80 per cent de les infeccions. Tanmateix, els casos greus impliquen complicacions hemorràgiques i neurològiques amb una taxa de mortalitat que oscil·la entre el 20 i el 30 per cent en pacients hospitalitzats [15].

És important destacar que una vacuna viva atenuada anomenada Candid # 1 ha demostrat ser molt eficaç per prevenir casos greus d'AHF [15,16]. Tanmateix, l'únic tractament disponible contra la malaltia és l'administració de plasma immune de pacients convalescents; una teràpia que s'ha demostrat que redueix el nombre de casos mortals només si s'administra dins dels 8 dies posteriors a l'aparició dels primers símptomes [17].

Tot i que en els darrers anys s'han reunit múltiples evidències sobre l'efecte de l'AHR durant les infeccions, encara no hi ha proves clares sobre el seu paper durant les infeccions per arenavirus [2].

Com que la població rural està exposada constantment a lligands AHR, com ara contaminants de la indústria agrícola com ara productes agroquímics, pesticides i subproductes de la combustió de combustibles fòssils [18], en aquest treball hem avaluat l'impacte de la modulació farmacològica de l'AHR in vitro en la resposta cel·lular a la infecció per JUNV i l'ús potencial de l'AHR com a objectiu candidat per a la intervenció terapèutica en la malaltia de l'AHF.

2. Materials i Mètodes

2.1. Línies cel·lulars

Es van utilitzar les següents línies cel·lulars: Huh-7 (JCRB Cell Bank #0403) i HepG-2 ATCC HB8065, dues línies cel·lulars de carcinoma derivats d'hepatòcits humans; Vero ATCC CCL-81, una línia cel·lular epitelial renal derivada del mico. Totes les línies cel·lulars es van conrear en el mitjà essencial mínim d'Eagle (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) complementat amb un sèrum de vedella nounat al 5% (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) i complementat amb Gentamicina 50 µg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), piruvat sòdic 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), L-glutamina 2 mM (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) i tamponat amb HCl/NaHCO3. Les línies cel·lulars es van cultivar i es van mantenir a 37 ◦ C amb una atmosfera de 5 per cent de CO2.

2.2. Soques virals

Es van utilitzar les següents soques virals: la soca IV4454 naturalment atenuada obtinguda a partir d'un cas humà lleu d'AHF [19] i la soca Candid#1 atenuada per vacuna [20]. Les cèl·lules Vero es van utilitzar tant per a la generació d'estoc de virus com per a la valoració de virus mitjançant un assaig estàndard de placa.

Tot el treball amb agents infecciosos es va realitzar en instal·lacions de nivell 2 de bioseguretat i aprovat per l'Oficina de Seguretat i Salut Ambiental de la Facultat de Ciències de la Universitat de Buenos Aires. Tot el personal implicat en els procediments d'infecció es va vacunar amb Candid-1 proporcionat per l'Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Aires, Argentina).

2.3. Anàlisi de microarrays

Es van sembrar un total de 5 × 105 cèl·lules HepG2 en matràs de cultiu de 25 cm2 i es van infectar amb JUNV IV4454 amb una multiplicitat d'infeccions (MOI) d'1 o infectades simulades. L'ARN es va extreure i es va purificar mitjançant RNAeasy (Qiagen, Hilden, Alemanya) a les 24 i 48 h després de la infecció (pi). Les concentracions d'ARN es van mesurar mitjançant Nanodrop. Els perfils d'expressió gènica de cèl·lules HepG2 es van caracteritzar mitjançant l'anàlisi de microarrays (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) per identificar gens hoste regulats transcripcionalment per la infecció.

El nombre total de gens hoste regulats significativament per la infecció es va calcular per a cada punt de temps mitjançant la identificació de gens que mostraven, almenys, un canvi d'expressió d'1,6-vegament i una probabilitat del 95% d'expressar-se de manera diferencial (p {{ 3}}.05).

El programari WebGestalt (http://www.webgestalt.org, consultat el 3 de juliol de 2020), que utilitza la base de dades Wikipathways, es va utilitzar per a les anàlisis d'ontologia gènica i de sobrerepresentació de vies. Es van realitzar experiments replicats en dies diferents (n=3 experiments independents per condició).

2.4. Compostos de molècules petites

L'antagonista competitiu sintètic específic de l'AHR CH223191, 1-Metil-N-[{2-metil{4-[2-({2-metilfenil)diazenil]fenil]{ La {9}}H-pirazol-5-carboxamida (Tocris Bioscience, Bristol, Regne Unit), es va solubilitzar en dimetilsulfòxid (DMSO) i es va utilitzar a una concentració d'1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 i 80 µM.

El metabolit del triptòfan L-quinurena, (2S)-2-amino-4-({2-aminofenil)-4-àcid oxobutanoic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) va ser solubilitzat en DMSO i utilitzat a una concentració de 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 i 320 µM.

Tots els tractaments es van realitzar en absència de llum, donat que els compostos presenten fotosensibilitat.

2.5. Assajos de viabilitat cel·lular

Per a la determinació de la viabilitat cel·lular, les monocapes de cèl·lules Huh-7 i Vero es van cultivar en plaques de 96 pous durant 24 hores en MEM 5% NBCS. Les monocapes cel·lulars al 90 per cent de confluència es van tractar amb diferents concentracions de CH223191 (1,25 µM a 80 µM) i quinurenina (5 µM a 320 µM) durant 72 h. Mock es va tractar amb la mateixa concentració de DMSO que la dosi més alta de tractament amb lligands i es va considerar el 100 per cent de la viabilitat cel·lular.

Tots els tractaments es van realitzar per quadruplicat. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant el bromur de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazoli (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). L'absorbància es va mesurar a 570 nm en un lector de microplaques FLUOstar OPTIMA. El percentatge de viabilitat cel·lular es va determinar relativitzant els resultats d'absorbància del tractament mitjançant valors d'absorbància simulada.

A més, es va estudiar la capacitat de creixement i la morfologia de les cèl·lules tractades amb un microscopi de llum. Les fotos es van fer a les 72 h amb un microscopi Nikon Eclipse TS100; augment: 100×; NA: 0,25.

2.6. Tractaments i infeccions víriques

Les monocapes cel·lulars Vero i Huh{{0}} es van pretractar amb CH223191 i quinurenina diluïda en MEM 1,5 per cent de NBCS durant 1 h o 24 h, respectivament, a 37 ◦C. CH223191 es va utilitzar a concentracions que oscil·laven entre 1,25 i 20 µM, mentre que la quinurenina es va utilitzar a concentracions que oscil·laven entre 5 i 80 µM. A continuació, es va realitzar la infecció viral amb la soca IV4454 o Candid # 1 amb un MOI de 0,5. Després d'1 h, es van eliminar els inòculs i les cèl·lules es van exposar als dos compostos durant 48 h a les concentracions esmentades. A les 48 h es van recollir els sobrenedants pi per a l'assaig de plaques i es van processar les monocapes cel·lulars per a immunofluorescència indirecta o RT-qPCR.

2.7. Immunofluorescència indirecta

Les monocapas -7 tractades amb CH223191 o quinurenina i infectades amb JUNV com s'ha esmentat anteriorment es van fixar a 48 h pi amb metanol durant 10 min a -20 ◦C, es van rentar tres vegades amb PBS i es van emmagatzemar en PBS fresc a 4 ◦C. fins a la seva tramitació.

Es van utilitzar els anticossos següents: anticossos monoclonals anti-NP de ratolí primaris (1:200) (NA05-AG12) [21] i anticossos de cabra anti-ratolí conjugats Alexa Fluor 488 secundaris (1:200) (A{{{ 10}}) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Els nuclis cel·lulars es van tacar amb 40,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Les dades de microscòpia i fotografia es van obtenir mitjançant un microscopi de fluorescència Olympus IX71 amb una càmera QImaging Exi-Aqua connectada (mida de píxels: 6,45 µm; àrea del fotodetector: 1392 × 1040 píxels2).

La quantificació de les dades de fluorescència es va realitzar mitjançant el programari Fiji (versió 1.53v) (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Les quantificacions manuals del nucli tacat amb DAPI i les cèl·lules positives NP es van realitzar manualment mitjançant el connector de comptador de cèl·lules inclòs al programari Fiji (versió 1.53v). Les cèl·lules es van considerar positives si es podia detectar la tinció d'antigen viral NP. El percentatge de cèl·lules NP positives es va expressar com la relació entre les cèl·lules NP positives i les cèl·lules totals de cada camp i després es va determinar i presentar el percentatge mitjà.

La intensitat de fluorescència de les cèl·lules NP positives es va obtenir mesurant el valor gris mitjà de cèl·lules individuals i restant la fluorescència de fons. Els focus virals es van delimitar considerant grups de cèl·lules NP positives envoltades de cèl·lules NP negatives. Els focus virals es van comptar amb 3 imatges diferents de 3 camps diferents escollits aleatòriament i la mida mitjana dels focus es va determinar pel nombre de cèl·lules que els van formar.

2.8. Detecció d'àcids nucleics virals

L'extracció d'àcid nucleic es va dur a terme a partir de monocapes de cèl·lules infectades mitjançant el kit Highway ADN/ARN PuriPrep-VIRUS K1501 (Autopista Inbio, Buenos Aires, Argentina), segons les instruccions del fabricant. La càrrega viral de l'ARN JUNV i la quantificació de transcripcions cel·lulars es van dur a terme mitjançant RT-qPCR. La transcripció inversa es va realitzar mitjançant cebadors aleatoris i la transcriptasa inversa del virus de la leucèmia murina Moloney (M-MLV RT).

Per a l'amplificació de fragments, es van utilitzar els següents cebadors: JUNV-np (en endavant: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, invers: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (Endavant: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; enrere: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( Reenviament: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Enrere: 50 -ATGGTTAGCCCATATAGATGGG{-30 ), -actin (Enviant: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17} }}; al revés: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30 ). Els detalls del cicle de PCR eren els següents: desnaturalització inicial 2 min a 95 ◦C; 45 cicles d'amplificació que consisteixen en 30 segons a 95 ◦C, 1 min a 58 ◦C i 1 min a 72 ◦C; un cicle final de 5 min a 72 ◦C; finalment, es van realitzar corbes de fusió. La detecció es va realitzar mitjançant l'equip MyiQ2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). Els resultats es van informar com a 2−∆∆Ct (canvi de plec) i es van normalitzar utilitzant -actina com a gen de neteja.

2.9. Assaig de plaques

Els rendiments virals es van determinar mitjançant un assaig estàndard de placa. Es van recollir sobrenedants cel·lulars i es van preparar dilucions en sèrie per infectar les monocapes de cèl·lules Vero durant 1 h a 37 ◦ C. Després de l'adsorció viral, es van eliminar els inòculs, es va afegir MEM al 5% de NBCS suplementat amb 0,7% de metilcel·lulosa i les cèl·lules es van incubar durant 1 setmana a 37 ◦ C en una incubadora al 5% de CO2. Després, es van fixar les monocapes cel·lulars amb un 10 per cent de formaldehid, es van rentar i es van tacar amb cristall violeta. El títol viral es va calcular després de la quantificació de la unitat de formació de placa (PFU).

2.10. Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística de microarrays es va realitzar mitjançant el programari WebGestalt (http://www.webgestalt.org/, consultat el 3 de juliol de 2020). Les dades es descriuen com a mitjana ± SD One-Way ANOVA amb la prova post hoc de Dunnett per GraphPad Prism 8 (versió 8.0.1) per a Windows 11 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) per avaluar la significació estadística. p Menys o igual a 0,05 es va considerar estadísticament significatiu.

For more information:1950477648nn@gmail.com