Anàlisis morfològiques de l'expressió de la nefrina en la glomerulonefropatia progressiva

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Resum:

En aquest estudi, ens hem centrat en la nefrina, una de les molècules clau dins del diafragma d'escletxa dels podòcits, ja que encara que hi ha hagut informes sobre la seva expressió en humans i rates, no s'ha informat de la seva presència en tití comuns. Hem investigat l'expressió de nefrina i els canvis en els glomèruls, depenent del desenvolupament de la glomerulonefropatia progressiva espontània en tití comuns. Es van avaluar dinou titís comuns de dos a deu anys d'edat. El ronyó es va examinar per microscòpia amb hematoxilina i eosina i tinció immunohistoquímica per a la nefrina. Les lesions es van classificar en tres graus segons un sistema de classificació de lesions renals informat anteriorment. L'àrea nefrina positiva es va mesurar mitjançant anàlisi morfomètrica i es va calcular la relació nefrina positiva. L'expressió de nefrina es va observar al llarg del bucle capil·lar glomerular en un patró lineal continu en els graus de lesió renal 0 a 2 i un patró lineal discontinu o granular gruixut al grau 3. L'expressió de nefrina va tendir a disminuir significativament en funció del grau de les lesions renals. . S'ha suggerit que l'alteració de l'expressió de nefrina té un paper important en la progressió de les lesions renals.

Paraules clau:nefrina, tití,glomerulonefropatia, ronyó, patologia

avantatges de cistanche del desertiPlanta de Cistancheés bo perronyó

Introducció

Se sap que la glomerulonefropatia progressiva espontània en tití comuns (Callithrix jacchus) es produeix amb freqüència a partir dels dos anys d'edat, amb la gravetat de la lesió progressant amb l'edat. Prèviament vam informar de lesions primàries i progressives de nefropatia en titís comuns1. Els canvis glomerulars primaris de la nefropatia en fase inicial es caracteritzen per l'esborrament dels processos podòcits del peu i l'engrossiment parcial de la membrana basal glomerular, que se suposa que causen fuites de proteïnes dels glomèruls, i es poden observar per ultramicroscòpia però no per microscòpia de llum1-3. A més, la immunoglobulina té un paper important en la progressió de la nefropatia1, 2. La IgM es diposita al mesangi en l'etapa inicial de la glomerulonefropatia, i després de la primera deposició d'IgM, l'àrea de dipòsit s'expandeix a tot el glomèrul, i la IgA i la IgG són dipositat amb progressió2. Els motlles hialins que suggereixen una fuga de proteïnes dels glomèruls es poden observar mitjançant microscòpia de llum amb la progressió de la glomerulonefropatia4. La proteinúria agreuja la progressió de les lesions tubulointersticials en els titís comuns4, com en els humans5, 6, i, en un estudi recent dels glomèruls, la proteinúria podria ser induïda per trastorns del diafragma de l'escletxa, enllaçant així els processos del peu adjacents (pedicels) del podòcit. El diafragma d'escletxa és un complex d'unió intercel·lular present entre processos del peu adjacents, i s'han identificat algunes molècules relacionades amb la seva formació3. Es va pensar que una disminució de l'expressió d'aquestes molècules o una disfunció del diafragma de l'escletxa estava relacionada amb la progressió de la proteinúria3. La nefrina, una de les molècules clau expressades al diafragma d'escletxa dels podòcits, és una glicoproteïna que consta de 1241 aminoàcids i és un biomarcador conegut que s'utilitza per controlar el trastorn dels diafragmas d'escletxa7-10. No s'han estudiat molècules relacionades amb els diafragmes d'escletxa en la nefropatia dels titís comuns, tot i que se sap que s'hi produeix l'alteració dels processos podòcits del peu i la progressió de la proteinúria. A més, hi ha hagut informes sobre l'expressió de nefrina en humans i rates7–12, però no en tití. Per tant, es va investigar l'expressió de nefrina als glomèruls i els canvis en l'expressió de la nefrina, en funció de la progressió de la lesió, mitjançant anàlisis immunohistoquímiques.

cistanche tcm

Materials i mètodes

Animals

Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Institució Central d'Animals Experimentals (CIEA; Kawasaki, Japó) i es va dur a terme d'acord amb el Reglament per a l'experimentació amb animals de la CIEA basat en les directrius per a la conducta adequada de Experiments amb animals (Consell científic del Japó, 2006). Es van avaluar dinou titís comuns (11 mascles i 8 femelles) de CLEA Japan Inc. (Tòquio, Japó). Les seves edats oscil·laven entre els 2 i els 10 anys en el moment de la necròpsia. Els animals es van allotjar en gàbies en una habitació d'animals mantinguda a una temperatura de 26 ± 3 graus i una humitat del 55 ± 20 per cent. S'han alimentat amb LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Tòquio, Japó) i aigua de l'aixeta. Els animals van ser sacrificats humanament sota anestèsia amb pentobarbital sòdic per diverses causes de moribunda (com la síntesis, la curvatura de les vèrtebres lumbars, la luxació de l'articulació mandibular, etc.). No es va fer l'anàlisi d'orina perquè no es va poder prendre mostres d'orina.

Histopatologia

Elronyonses van perfondre amb solució salina, seguit d'un 4% de paraformaldehid i després es van fixar en formalina tamponada amb un 10% de tampó neutre per a un examen microscòpic. Els exemplars es van incrustar en parafina, es van seccionar a 5 μm de gruix i es van tacar amb hematoxilina i eosina (HE). Les lesions es van classificar com a lesions glomerulars, tubulars i intersticials segons criteris publicats1. Els graus de nefropatia es van dividir en quatre grups: grau 1 (3 homes i 1 dona), grau 2 (3 homes i 5 dones), grau 3 (1 home i 3 dones) i grau 4 (3 homes) (taula 1).

Per a la immunohistoquímica, un anticòs monoclonal contra el domini extracel·lular d'origen humànefrina(1:1,000, Nefrinag{{0}}, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EUA) es va utilitzar com a anticossos primari. Les seccions de 5-μm es van desparafinar, es van rehidratar, es van tractar amb peròxid d'hidrogen al 3% a temperatura ambient durant 5 minuts i després es van escalfar en un autoclau a 121 graus durant 20 minuts en una solució de recuperació diana (pH 6, 0, Dako, Glostrup, Dinamarca). Després del refredament, les seccions es van incubar amb l'anticòs primari a 4 graus durant la nit. El polímer IgG anti-ratolí i anti-conill conjugat amb peroxidasa (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Tòquio, Japó) es va utilitzar com a anticossos secundari per al mètode basat en polímers13. Les seccions es van incubar amb l'anticossos del polímer secundari a temperatura ambient durant 30 min i els productes que reaccionen es van visualitzar utilitzant 3,3'-diaminobenzidina com a cromogen. La contratinció es va realitzar amb hematoxilina. Per al control negatiu, es va ometre l'anticossos primari.

Anàlisi morfològica

Per a l'anàlisi morfològica, es van enviar els glomèruls amb l'hile glomerular per a l'examen i es van capturar de 16 a 28 glomèruls a cada diapositiva (taula 1) mitjançant un escàner de diapositives sencer (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, EUA) i un programari de visualització de diapositives de patologia corresponent (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) amb la mateixa resolució i mida d'imatge.Nefrina-Les àrees glomerulars positives i senceres es van calcular amb un programari d'anàlisi d'imatges (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Rockville MD, EUA) dibuixant una regió d'interès al voltant del glomèrul, segons un informe anterior14. Es va definir tota l'àrea glomerular com l'àrea que es pot distingir del fons de color blanc. Els llindars de color per calcularnefrina-Es van determinar les zones positives segons cada condició de tinció. Els llindars de vermell, verd i blau eren 37–67, 31–77 i 32–88, respectivament. La relació nefrina positiva es va calcular dividint les mesures de lanefrina-àrea positiva sobre la zona glomerular. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant la prova Jonckheere (nivell de significació: 5 per cent, prova unilateral) per avaluar la tendència entre el grau de nefropatia i l'expressió denefrina.

costanch

Resultats

Les puntuacions patològiques i els graus de les lesions renals individuals es mostren a la taula 1. Igual que en el nostre primer informe1, el grau de lesió va tendir a augmentar amb l'edat i no hi havia cap diferència òbvia de sexe. Els resultats de la tinció immunohistoquímica denefrinaes mostren a la figura 1, i elnefrina-positiu es mostra a la figura 2 i a la taula 1. Entre les puntuacions i qualificacions de la taula 1, es va utilitzar el grau de lesió renal, derivat de la puntuació total de cada lesió renal, i la puntuació de fosa hialina per a la comparació amb lanefrina-ràtio positiva (Fig. 2 i 3). Els casos individuals a la taula 1 es mostren en ordre ascendent del grau de lesió renal. Es va observar l'expressió de nefrina juntament amb el bucle capil·lar glomerular en un patró lineal continu en els graus 0 a 2 (Fig. 1A-C) i un patró granular lineal discontinu o gruixut als graus 3 (Fig. 1D). A la mostra de control negatiu, no hi ha cap reacció positivanefrinas'ha observat en qualsevol lloc.

La comparació de lanefrinaLa relació positiva amb el grau de lesió renal es mostra a la figura 2. En els casos de grau de lesió renal 0, la mitjana ± desviació estàndard (DE) de lanefrina-positiu va ser del 5,66 ± 1,18 per cent, i els valors màxim, mínim i mitjà van ser del 6,84 per cent, 4,27 per cent i 5,76 per cent, respectivament. En els casos de grau 1, la mitjana ± SD va ser del 3,99 ± 1,61 per cent, i els valors màxim, mínim i mitjà eren del 5,69 per cent, 1,19 per cent i 4,35 per cent, respectivament. En els casos de grau 2, la mitjana ± SD va ser de 3,82 ± 2,25 per cent, i els valors màxim, mínim i mitjà eren de 6,71 per cent, 1,58 per cent i 3,49 per cent, respectivament. En els casos de grau 3, la mitjana ± DE va ​​ser del 2,52 ± 1.02 per cent, i els valors màxim, mínim i mitjà eren del 3,67 per cent, 2,17 per cent i 2,17 per cent, respectivament. Col·lectivament, les diferències individuals en l'expressió de la nefrina eren petites en els casos de grau 0, però grans en els casos de grau 1 o superior, i es va detectar esporàdicament una expressió positiva baixa.Nefrinal'expressió va tendir a disminuir en funció del grau de les lesions renals (Fig. 2). Hi va haver una tendència significativament menor entre el grau de lesió renal inefrina-ràtio positiva segons la prova de Jonckheere (p=0.0166). La puntuació del motlle hialí en comparació amb el grau de lesió renal es mostra a la figura 3. En els casos amb una puntuació del motlle hialí de 0, la mitjana ± SD de la proporció positiva de nefrina va ser de 5,40 ± 1,32 per cent, en els casos de puntuació 1, va ser de 4,10. ± 1,70 per cent, i en la puntuació 2 casos, va ser del 3,37 ± 1,98 per cent. Hi va haver una tendència significativament més baixa entre la puntuació de la fosa hialina i la proporció positiva de nefrina segons la prova de Jonckheere (p=0,0654).

Discussió

Una disminució de la nefrina es va correlacionar amb la progressió de les lesions renals durant el desenvolupament de la glomerulonefropatia de tití. L'anticòs anti-nefrina utilitzat en aquest estudi va reconèixer el domini extracel·lular al costat N-terminal. Aquest domini extracel·lular interacciona amb les molècules NEPH1 i forma una estructura semblant a una cremallera dins del diafragma d'escletxa15. La localització de la nefrina en glomèruls normals es troba al llarg del bucle capil·lar glomerular i el patró de tinció és un patró lineal de grànuls fins i continus tant en rates com en humans11, 12, 16–18. La tinció realitzada en aquest estudi és adequada; la qual cosa es confirma amb l'observació que les parets capil·lars en contacte amb la regió mesangial no estaven tacades, mentre que les en contacte amb els podòcits sí. En condicions anormals, com la síndrome nefròtica en humans o la nefrosi d'aminonucleòsids de puromicina en rates, el patró de tinció de nefrina als glomèruls és discontinu i granular gruixut, i la intensitat de la tinció immunohistoquímica és més feble que en els glomèruls normals11, 16, 17. En el present estudi. , el patró d'expressió de nefrina als graus 0 a 2 era normal; tanmateix, el patró de tinció dels graus 3 era comparable al de les condicions anormals. En una investigació prèvia de l'expressió de nefrina glomerular en rates Crl: CD (SD) amb malaltia de canvi mínim, l'expressió de nefrina estava intacta, tot i que els processos del peu podòcit van mostrar esborrament sota microscòpia electrònica sense canvis morfològics aparents observats sota microscòpia de llum18. En la malaltia renal comuna de rates, la nefropatia progressiva crònica (NPC), s'ha demostrat que l'albumínúria acompanyada de la CPN en fase inicial pot provocar menys canvis en la permeabilitat glomerular a causa de la manca de reabsorció de l'albúmina dels túbuls proximals19. En humans, hi ha hagut algunes investigacions sobre la reducció de l'expressió de nefrina sota canvis menors10 o sota altres malalties renals14, 16. D'altra banda, s'ha informat sobre l'expressió de nefrina intacta en la nefrosi de canvi mínim20. Encara s'està discutint la presència o absència d'un canvi en l'expressió de nefrina en la malaltia nefròtica de canvi mínim. En realitat, va ser difícil confirmar l'augment o la disminució de la reacció d'anticossos de la nefrina mitjançant l'observació visual en la nefropatia del tití, però va ser possible detectar el canvi a tot el ronyó mitjançant l'anàlisi d'imatges. La nostra investigació suggereix que l'anormalitat dels diafragmes d'escletxa del glomèrul pot estar implicada en la progressió de la nefropatia en titís comuns a causa d'una disminució de la nefrina. La transformació del patró de tinció positiva de la nefrina, de lineal a patró granular, s'ha informat en un model animal de rata de malaltia nefròtica durant el desenvolupament de la lesió11, 16, 21. S'ha trobat una associació entre anomalies de la membrana de l'escletxa i proteinúria. s'ha informat amb freqüència22, 23; per tant, s'ha especulat que la proteinúria pot ser causada per una disfunció del diafragma d'escletxa. En el nostre estudi sobre la nefropatia del tití, la progressió de la permeabilitat de les proteïnes glomerulars a causa de la disfunció del diafragma escletxa podria haver-se produït perquè les característiques morfològiques dels motlles hialines només es van observar en els casos sense canvis tubulointersticials. En aquest estudi, no es va observar cap diferència estadísticament significativa entre la puntuació dels canvis morfològics dels motlles hialins i la disminució de l'expressió de nefrina. No obstant això, l'expressió de nefrina tendeix a disminuir en funció de la puntuació de fosa hialina, que és un indicador de la fuita de proteïnes del glomèrul.

En la nostra investigació anterior, es va observar l'esborrament dels processos del peu en l'etapa inicial de la nefropatia del tití i l'àrea del procés del peu afectat es va ampliar en funció del grau de lesió renal1. La taula 2 mostra la relació entre la taxa de reducció de la nefrina en aquest estudi i els resultats de la microscòpia electrònica per a cada grau de lesió renal d'un estudi anterior. Es creu que l'esborrament es deu a una ruptura del citoesquelet d'actina dels processos del peu24. La nefrina es desfosforila quan es construeix la membrana de l'escletxa, i s'uneix a l'actina mitjançant CD2AP i podocina25, 26. Quan es lesiona un diafragma d'escletxa, les molècules de nefrina s'agrupen, induint la fosforilació de la nefrina, la polimerització de l'actina i l'esborrament dels processos del peu26. La fosforilació de la nefrina també es produeix ràpidament després de la inducció de l'esborrament del procés del peu en el model de sulfat de protamina en ratolins27. La nefrina és una proteïna d'adhesió glomerular associada a la maduració, diferenciació, formació de processos i senyalització dels podòcits24. La nostra investigació va demostrar que hi havia una correlació entre la reducció de l'expressió de nefrina, determinada per la immunohistoquímica, i la progressió del grau de lesió renal, cosa que suggereix una expansió de l'esborrament dels processos del peu podòcit. No obstant això, no està clar si les anomalies en el complex proteic del diafragma d'escletxa causen danys als processos del peu del podòcit o si el dany del podòcit provoca canvis en els diafragmes d'escletxa i la reducció de la nefrina. Com que la nefrina també està implicada en la diferenciació dels podòcits, es creu que aquesta relació s'aclarirà encara més amb les dades sobre la regeneració i la diferenciació dels podòcits.

En conclusió, els nostres resultats proporcionen informació sobrenefrinaexpressió en glomerulonefropatia progressiva en tití comuns. L'anàlisi morfològica va revelar una tendència més baixa denefrinaexpressió en podòcits en la glomerulonefropatia progressiva de tití comuns i l'alteració denefrinaEs va suggerir que l'expressió tenia un paper important en la progressió de les lesions renals.

Divulgació de possibles conflictes d'interessos:

Els autors declaren que no tenen conflictes d'interessos.

Reconeixement:

Els autors volen agrair al Sr. Takayoshi Ito l'excel·lent assistència tècnica que va oferir. Els autors també agraeixen a la Sra Kanae Tamatsukuri i al Sr. James Harada l'edició lingüística del manuscrit.

resistència

Referències
1. Yamada N, Sato J, Kanno T, Wako Y i Tsuchitani M. Estudi morfològic de la glomerulonefropatia progressiva en titís comuns (Callithrix jacchus). Toxicol Pathol. 41: 1106–1115. 2013.
2. Yamada N, Hashimoto N, Kamiie J, Doi T, Sato J, Inoue T, Shirota K i Tsuchitani M. Relació entre la deposició d'immunoglobulines i les lesions primerenques de la glomerulonefropatia progressiva en marmosets comuns joves. Veterinària Pathol. 55: 173–176. 2018.
3. Cara-Fuentes G, Clapp WL, Johnson RJ i Garin EH. Patogènesi de la proteinúria en la malaltia de canvi mínim idiopàtic: mecanismes moleculars. Pediatr Nefrol. 31: 2179–2189. 2016.
4. Isobe K, Adachi K, Hayashi S, Ito T, Miyoshi A, Kato A i Suzuki M. Lesions glomerulars i tubulointersticials espontànies en titís comuns (Callithrix jacchus). Veterinària Pathol. 49: 839–845. 2012.
5. Eddy AA. Proteïnúria i lesió intersticial. Trasplantament de Nephrol Dial. 19: 277–281. 2004.
6. Hingorani S, Gooley T, Pao E, Sandmaier B i McDonald G. Citocines urinàries després de l'HCT: evidència d'inflamació renal en la patogènesi de la proteinúria ironyómalaltia. Trasplantament de medul·la òssia. 49: 403–409. 2014.
7. Kestilä M, Lenkkeri U, Männikkö M, Lamerdin J, McCready P, Putaala H, Ruotsalainen V, Morita T, Nissinen M, Herva R, Kashtan CE, Peltonen L, Holmberg C, Olsen
A i Tryggvason K. El gen clonat en posició per a una nova proteïna glomerular--nefrina-- està mutat en la síndrome nefròtica congènita. Cèl·lula Mol. 1: 575–582. 1998.
8. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, Thomson NM, Holthöfer H, Zaoui P, Pinel N, Cordonnier DJ i Gilbert RE. La proteinúria i l'expressió de la proteïna del diafragma de la ranura del podòcit, la nefrina, en la nefropatia diabètica: efectes de la inhibició de l'enzim convertidor d'angiotensina. Diabetologia. 45: 572–1576. 2002.
9. Welsh GI i Saleem MA. Molècula de signatura de nefrina del podòcit glomerular? J Pathol. 220: 328–337. 2010.
10. van de Lest NA, Zandbergen M, IJpelaar DHT, Wolterbeek R, Bruijn JA, Bajema IM i Scharpfenecker M. La pèrdua de nefrina es pot utilitzar per predir la remissió i el resultat renal a llarg termini en pacients amb malaltia de canvi mínim.RonyóInt Rep. 3: 168–177. 2017.
11. Kawachi H, Koike H, Kurihara H, Yaoita E, Orikasa M, Shia MA, Sakai T, Yamamoto T, Salant DJ i Shimizu F. Clonació de la nefrina de rata: expressió en els glomèruls en desenvolupament i en estats proteïnúrics.RonyóInt. 57: 1949–1961. 2000.
12. Luimula P, Ahola H, Wang SX, Solin ML, Aaltonen P, Tikkanen I, Kerjaschki D i Holthöfer H. Nephrin en la malaltia glomerular experimental.RonyóInt. 58: 1461–1468. 2000.
13. Janardhan KS, Jensen H, Clayton NP i Herbert RA. Immunohistoquímica en patologia investigativa i toxicològica. Toxicol Pathol. 46: 488–510. 2018.
14. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, De Heer E, Paul LC i Bruijn JA. Expressió de molècules associades a podòcits en humans adquiritsronyómalalties. J Am Soc Nephrol. 14: 2063–2071. 2003.
15. Gerke P, Huber TB, Sellin L, Benzing T i Walz G. Homodimerització i heterodimerització de les proteïnes del podòcit glomerular nefrina i NEPH1. J Am Soc Nephrol. 14: 918–926. 2003.
16. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG, Reponen P, Tryggvason K i Camussi G. La redistribució de la nefrina als podòcits és un mecanisme potencial per a la proteinúria en pacients amb síndrome nefròtica primària adquirida. Sóc J Pathol. 158: 1723–1731. 2001.
17. Kawakami H, Kamiie J, Yasuno K, Kobayashi R, Aihara N i Shirota K. Dinàmica de la quantitat absoluta de nefrina en un sol podòcit en rates de nefrosi d'aminonucleòsids de puromicina calculada mitjançant un enfocament de proteòmica glomerular quantitativa amb el mode de seguiment de la reacció seleccionat. Trasplantament de Nephrol Dial. 27: 1324–1330. 2012.
18. Yasuno K, Honda K, Hakamata S, Kai K i Mori K. Malaltia de canvi mínim de laronyóen una jove rata Sprague Dawley. J Toxicol Pathol. 31: 55–59. 2018.
19. Obert LA, i Frazier KS. Implicació del sistema renina-angiotensina intrarenal en la patogènesi de la nefropatia progressiva crònica, que redueix la bretxa informativa entre disciplines. Toxicol Pathol. 47: 799–816. 2019.
20. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason K i Jalanko H. Expression of nephrin in pediatriaronyómalalties. J Am Soc Nephrol. 12: 289–296. 2001.
21. Saran AM, Yuan H, Takeuchi E, McLaughlin M i Salant DJ. El complement media la redistribució de la nefrina i la dissociació de l'actina en la nefropatia membranosa experimental.RonyóInt. 64: 2072–2078. 2003.
22. Gagliardini E, Benigni A, Tomasoni S, Abbate M, Kalluri R i Remuzzi G. Reducció dirigida de la nefrina extracel·lular en la nefropatia IgA humana. Sóc J Nephrol. 23: 277–286. 2003.
23. Wakamatsu A, Fukusumi Y, Hasegawa E, Tomita M, Watanabe T, Narita I i Kawachi H. Role of calcineurin (CN) inronyóPodòcit glomerular: l'inhibidor del CN ​​va millorar la proteinúria inhibint la redistribució del CN ​​al diafragma de l'escletxa. Physiol Rep. 4: e12679. 2016.
24. Garg P. Una revisió de la biologia dels podòcits. Sóc J Nephrol. 47 (Suppl 1): 3–13. 2018.
25. Ichimura K, Kurihara H i Sakai T. Organització del filament d'actina dels processos del peu en podòcits de rata. J Histochem Citoquímica. 51: 1589–1600. 2003.
26. Ronco P. Proteinúria: està tot al peu? J Clin Invest. 117: 2079–2082. 2007.
27. Verma R, Kovari I, Soofi A, Nihalani D, Patrie K i Holzman LB. La implicació de l'ectodomini de la nefrina dóna lloc a l'activació de la cinasa Src, la fosforilació de la nefrina, el reclutament de Nck i la polimerització de l'actina. J Clin Invest. 116: 1346–1359. 2006.