Norwogonin atenua l'estrès oxidatiu i l'apoptosi induïts per la hipòxia a les cèl·lules PC12

Per a més informació:ali.ma@wecistanche.com

Resum

Antecedents: Norwogonin és una flavona natural amb tres grups hidroxil fenòlics en estructura esquelètica i té una excel·lentantioxidantactivitat. Tanmateix, l'efecte neuroprotector de la norwogonina no està clar. Aquí, vam investigar la capacitat protectora de la norwogonina contra el dany oxidatiu provocat per la hipòxia a les cèl·lules PC12. Mètodes: es van examinar la viabilitat cel·lular i l'apoptosi mitjançant l'assaig MTT i la tinció d'Annexina V-FITC/PI, respectivament. El contingut d'espècies reactives d'oxigen (ROS) es va mesurar mitjançant l'assaig DCFH-DA. Lactat deshidrogenasa (LDH), malondialdehid (MDA) iantioxidantEls nivells d'enzims es van determinar mitjançant kits comercials. L'expressió de gens i proteïnes relacionades es va mesurar mitjançant PCR quantitativa en temps real i Western blotting, respectivament. Resultats: vam trobar que la norwogonina va alleujar la lesió induïda per la hipòxia a les cèl·lules PC12 augmentant la viabilitat cel·lular, reduint l'alliberament de LDH i millorant els canvis en la morfologia cel·lular. Norwogonin també va actuar com aantioxidanteliminant ROS, reduint la producció de MDA, mantenint les activitats de la superòxid dismutasa (SOD), catalasa (CAT) i glutatió peroxidasa (GPx) i disminuint els nivells d'expressió de HIF-1 i VEGF. A més, la wogonina va prevenir l'apoptosi cel·lular mitjançant la inhibició dels nivells d'expressió de caspasa-3, citocrom c i Bax mentre augmentava els nivells d'expressió de Bcl-2 i la proporció de Bcl-2/Bax. Conclusions: Norwogonin atenua la lesió induïda per la hipòxia a les cèl·lules PC12 apagant ROS, mantenint les activitats deantioxidantenzims i inhibint la via de l'apoptosi mitocondrial.

Paraules clau: Norwogonin,Activitat antioxidant, Hipòxia, Estrès oxidatiu, Apoptosi

Fons

Els organismes aeròbics necessiten oxigen (O2) per produir energia. La hipòxia es defineix com un subministrament insuficient d'O2 per mantenir la funció cel·lular en els teixits i sovint es produeix en algunes situacions fisiològiques com l'altitud elevada [1] i en moltes situacions patològiques com l'ictus [2]. El cervell és especialment sensible a les lesions induïdes per la hipòxia a causa del seu alt consum d'oxigen, ric en àcids grassos insaturats i baixantioxidantcapacitat [3]. L'evidència creixent ha indicat que la hipòxia pot induir efectes adversos al cervell [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia i Huiping Ma

Departament de Farmàcia, el 940è Hospital de la força de suport logístic conjunt de PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Xina

L'estrès oxidatiu i l'apoptosi es consideren dos factors que contribueixen a la lesió induïda per la hipòxia [7, 8]. S'ha informat que l'exposició a la hipòxia augmenta la producció d'espècies reactives d'oxigen intracel·lular (ROS), que facilita l'estrès oxidatiu. L'excés de ROS, com ara l'anió superòxid (O2−˙), el peròxid d'hidrogen (H2O2) i el radical hidroxil (HO•), provoca canvis cel·lulars estructurals i funcionals en atacar lípids, membranes, proteïnes i ADN i, posteriorment, provoca danys cel·lulars. 9].

Feu clic a Cistanches per obtenir un antioxidant

Simultàniament, la ROS sobreproduïda també facilita l'obertura del porus de transició de la permeabilitat mitocondrial (mPTP) [10] i la transferència de proteïnes pro-apoptosi a la membrana mitocondrial externa, la qual cosa indueix la despolarització de les membranes mitocondrials i l'alliberament del citocrom c [11]. Aquests canvis en última instància causen apoptosi dependent dels mitocondris [12]. Per tant, es creu queantioxidantsamb la capacitat d'inhibir o eliminar l'excés de ROS poden exercir el seu efecte protector mitjançant l'atenuació de l'estrès oxidatiu i l'apoptosi induïda per la hipòxia. Molts estudis ho han demostratantioxidantsuplements com la vitamina C [13], la isoflavona [8] i els radicals nitròxid [14], poden limitar les lesions induïdes per la hipòxia in vitro i in vivo. Els flavonoides són una classe àmplia i diversa de metabòlits secundaris de plantes omnipresents. Sempre es consideren un excel·lent naturalantioxidantamb la capacitat d'eliminar els radicals lliures i inhibir la peroxidació lipídica.

Actualment, cada cop s'ha prestat més atenció a aquesta classe de compostos pels seus efectes beneficiosos sobre la salut humana. S'ha demostrat que els flavonoides posseeixen una àmplia gamma d'accions farmacològiques, com ara activitat antiinflamatòria, antinociceptiva i neuroprotectora, etc., totes les quals es poden atribuir a les seves activitats antioxidants [15]. Molts estudis han indicat que els flavonoides presenten excel·lents efectes protectors sobre la fallada induïda per la hipòxia. Per exemple, la rutina té un fort efecte neuroprotector contra la mort de cèl·lules ganglionars de la retina induïda per la hipòxia [16]. Un estudi recent també demostra que la rutina pot alleujar el dany de la hipòxia induït pel clorur de cobalt mitjançant la inhibició de l'estrès oxidatiu i l'apoptosi a les cèl·lules H9c2 [17]. A més, Liu et al suggereixen que la nobiletina (3′,4′,5,6, 7,8-hexametoxi flavona) atenua la lesió I/R del miocardi mitjançant l'activació de la via Akt/GSK-3 a la cèl·lula H9c2 [18]. A més, l'acacetina pot protegir els cardiomiòcits de rata i els cardiomioblasts H9C2 contra lesions induïdes per hipòxia/reoxigenació mitjançant l'activació mediada per AMPK de la via de senyalització Nrf2 [19].

Norwogonin (5,7,8-trihidroxiflavona, Fig. 1) és una flavona farmacològicament activa separada de l'arrel de Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" en xinès), una herba tradicional xinesa que s'utilitza per tractar la grip i el càncer. [20, 21]. Tanmateix, s'han informat estudis limitats sobre les activitats biològiques de la norwogonina a causa dels seus baixos nivells en plantes naturals. Per abordar aquest problema, s'informa de diversos mètodes de síntesi de norwogonina [22, 23].

El nostre estudi anterior també va establir un mètode senzill per obtenir norwogonina a partir de crisina en quatre passos [24]. Aquestes investigacions han influït positivament en l'avaluació posterior de les activitats biològiques de la norwogonina. Els estudis han revelat que la norwogonina posseeix activitats antioxidants [25], anticancerígenes [26, 27], antivirals [28] i antimicrobianes [29], així com inhibeix la producció de ROS estimulada amb cianur [30]. Tanmateix, encara es desconeix si la norwogonina té capacitats protectores contra lesions induïdes per la hipòxia. L'objectiu del present estudi era investigar els efectes protectors de la norwogonina contra l'estrès oxidatiu induït per la hipòxia i l'apoptosi a les cèl·lules PC12.

Mètodes

Materials i reactius

La norwogonina (puresa superior o igual al 98 per cent) es va sintetitzar segons el nostre mètode informat anteriorment [24]. La rutina (puresa superior o igual al 96 per cent) es va comprar a Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Xina). La norwogonina i la rutina es van dissoldre en dimetil sulfòxid (DMSO) estèril, es van emmagatzemar a -20 graus i es van diluir al medi de cultiu cel·lular immediatament abans de l'ús. El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM), el sèrum boví fetal (FBS), l'estreptomicina i la penicil·lina es van comprar a Solarbio Co., Ltd. (Beijing, Xina).

Els kits de malondialdehid (MDA), lactat deshidrogenasa (LDH), superòxid dismutasa (SOD), catalasa (CAT) i glutatió peroxidasa (GPx) es van obtenir del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Xina). Diacetat de 2′,7′-diclorur-hidrofluoresceïna (DCFH-DA) i (3-(4,{5-dimetiltiazol{-2-il)-2,5- difeniltetrazoli bromur) tetrazoli (MTT) es va obtenir de Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, EUA). Anticossos primaris per al factor induïble per la hipòxia-1 (HIF{-1 ), factor de creixement endotelial vascular (VEGF), limfoma de cèl·lules B-2 (Bcl{-2), Bcl{{17 }} La proteïna X associada (Bax), la caspasa-3, el citocrom C i l'actina es van comprar a Abcam (Cambridge, Regne Unit). Els anticossos secundaris es van obtenir de la companyia ZsBio (Beijing, Xina).

Es va obtenir un kit d'anàlisi d'apoptosi del Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Xina). Tots els productes químics i dissolvents eren de grau analític i es van obtenir d'un proveïdor comercial a la Xina. Cultiu cel·lular Les cèl·lules PC12 es van comprar al Banc de cèl·lules de l'Acadèmia Xinesa de Ciències (TCR 9, Xangai, Xina) i es van mantenir a DMEM amb un 10% (v/v) de FBS, 100 U/mL de penicil·lina i 100 U/mL d'estreptomicines. a 37 graus en una incubadora humidificada que conté un 5 per cent de CO2. Per avaluar la citotoxicitat de la norwogonina, les cèl·lules PC12 (passatge 4 ~ 6) es van pre-incubar amb diferents concentracions (10−8, 10−7, 10−6, 10−5, 10−4 mol/L) de norwogonin per a 1 h i després es cultiva durant 24 h. Exposició a la hipòxia Per induir el model de lesió per hipòxia cel·lular, les cèl·lules PC12 van ser sotmeses a un entorn d'hipòxia (1 per cent d'O2, 5 per cent de CO2 i 94 per cent de N2) a 37 graus durant 24 h en una cambra humidificada. Les cèl·lules de control normoxic es van cultivar a 37 graus en una incubadora al 5% de CO2 durant 24 h.

Per avaluar l'efecte protector de la norwogonina contra la lesió induïda per la hipòxia, les cèl·lules PC12 es van preincubar amb diferents concentracions (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) de norwogonina durant 1 h abans del tractament amb hipòxia. Viabilitat cel·lular La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant un assaig MTT tal com es va descriure anteriorment [31]. En resum, es van sembrar cèl·lules PC12 (1 × 105 cèl·lules/ml) en plaques de cultiu de 96 pous. A continuació, es van afegir diferents concentracions de norwogonina als pous. Es va afegir un volum igual de DMSO als pous de control. La concentració final de DMSO al medi de cultiu cel·lular és del 0,1 per cent. Després de la incubació en condicions normoxiques o hipòxia, es van afegir 10 μL de MTT (5, 0 mg/mL) a cada pou, seguit d'incubació a 37 graus durant 4 h. A continuació, es va eliminar el sobrenedant amb MTT i el producte de formazà es va dissoldre en 100 μL de DMSO. L'absorbància es va mesurar en un lector de microplaques SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) a 570 nm. Els resultats es van expressar com el percentatge relatiu del grup control. Les cèl·lules PC12 amb tinció d'hematoxilina i eosina (HE) sembrades en cobertors de vidre es van incubar durant 24 hores abans de ser tractades amb norwogonina de la mateixa manera que es descriu anteriorment.

Es va eliminar el medi i es van rentar els cobertors de vidre amb PBS fred, seguit de la fixació amb metanol durant 10 min a temperatura ambient, i després es van rentar amb PBS fred tres vegades durant 5 min. Finalment, les cèl·lules es van tacar segons el protocol de tinció HE [32]. Les anàlisis de la cèl·lula es van realitzar mitjançant un microscopi OLYMPUS IX73 (100×) per tal de verificar els canvis morfològics cel·lulars. Les imatges digitals es van obtenir mitjançant la càmera digital DXM 1200 C (Nikon) associada al microscopi. Contingut de ROS El nivell de ROS intracel·lular a les cèl·lules PC12 es va determinar mitjançant l'assaig DCFH-DA [33]. Breument, les cèl·lules PC12 (1 × 105 cèl·lules/ml) es van sembrar en plaques 6-pous. Després del tractament amb hipòxia, les cèl·lules PC12 es van rentar amb PBS i després es van incubar al medi de cultiu que contenia 10 μM de DCFH-DA durant 30 min a la foscor a 37 graus. Les cèl·lules es van observar amb un microscopi de fluorescència invertida Olympus (Tòquio, Japó) i es van analitzar amb un citòmetre de flux Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, EUA) amb una longitud d'ona d'excitació de 488 nm i una longitud d'ona d'emissió de 525 nm. El nivell de ROS es va expressar com a percentatge relatiu de control. Les fuites de LDH, el contingut de MDA i l'activitat enzimàtica antioxidant Les cèl·lules PC12 (1 × 105 cèl·lules/mL) es van sembrar en un plat de 90 mm. Després del tractament d'hipòxia tal com es descriu anteriorment, es van recollir 50 μL de sobrenedant de cultiu de cada plat i es va detectar l'activitat de LDH al medi mitjançant kits d'assaig comercials (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Xina) i es va expressar com a U/mL. Les cèl·lules PC12 es van collir i homogeneïtzar després de rentar dues vegades amb PBS fred. La concentració de proteïna total es va mesurar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes BCA. El contingut de MDA i l'activitat enzimàtica antioxidant es van determinar mitjançant kits d'assaig comercials (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Xina).

El contingut de MDA es va presentar com a proteïna nmol/mg. Les activitats de SOD, CAT i GPx es van presentar com a proteïna U/mg. Apoptosi cel·lular (tinció d'Annexin-V/PI) Després del tractament amb hipòxia, es van recollir cèl·lules PC12, es van rentar dues vegades amb PBS fred i després es van suspendre amb tampó d'unió. Les cèl·lules es van tractar amb la solució Annexin V-FITC i PI seguint el protocol del fabricant (Beyotime, Xangai, Xina). Les recopilacions de dades es van realitzar mitjançant el citòmetre de flux Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, EUA). Anàlisi quantitativa de PCR en temps real L'ARN total de les cèl·lules PC12 es va extreure mitjançant el reactiu Trizol (Takara, Dalian, Xina) i es va convertir en ADNc mitjançant el kit de reactiu PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, Xina). L'ADNc que codifica HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, caspasa{-3, citocrom C i gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) es va amplificar mitjançant quantitats reals. PCR de temps mitjançant un sistema de detecció en temps real 7300 (Applied Biosystems, CA, EUA). Els primers utilitzats es van mostrar a la taula 1. Les condicions de cicle de PCR van ser de 95 graus durant 30 s, seguits de 40 cicles de 95 graus durant 5 s i 60 graus durant 31 s. Els nivells d'ARNm es van calcular mitjançant el mètode 2-ΔΔCt i es van normalitzar a GAPDH, que és el gen de referència. Les cèl·lules PC12 de Western blot es van recollir i homogeneïtzar en agents RIPA. La concentració de proteïnes totals es va quantificar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes BCA. Es van resoldre 30 ug de mostres amb electroforesi SDS-PAGE del 12% i després es van transferir a membranes de fluorur de polivinilidè (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EUA).

Les membranes es van bloquejar amb un 5% de llet seca sense greix en tampó TBST durant 1 h a temperatura ambient i es van incubar amb anticossos primaris: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Regne Unit), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, Regne Unit), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, Regne Unit), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Regne Unit), anti caspasa-3 (1:300, ab44976, Abcam, Regne Unit), anti citocrom C (1:1000, ab13575, Abcam, Regne Unit) i anti- -actina (1:2000, ab8227) , Abcam, Regne Unit) a 4 graus durant la nit. A continuació, es van rentar les membranes i es van incubar amb anticossos secundaris (1:2000, ZsBio, Beijing, Xina;) durant 1 h a temperatura ambient. Les bandes immunoreactives es van visualitzar mitjançant reactius de quimioluminescència millorada (ECL). Les intensitats relatives de les bandes es van normalitzar al control intern de -actina i es van analitzar mitjançant Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, EUA).

Anàlisi estadística

Els resultats es van expressar com a mitjana ± SD derivada d'almenys tres experiments independents. La diferència entre grups es va analitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) seguida de la prova post hoc de Student–Newman–Keuls. Un valor P de <0,05 es="" va="" considerar="" estadísticament="">

Resultats

Cèl·lules PC12 protectores de Norwogonin contra lesions induïdes per la hipòxia

En primer lloc, per evitar l'activitat proliferativa de la norwogonina, es va determinar la seva citotoxicitat en cèl·lules PC12 normals mitjançant un assaig MTT. Com es veu a la figura 2a, la proliferació cel·lular no es va modificar significativament després del tractament amb norwogonina a concentracions d'1 × 10− 8 -1 × 10− 5 mol/L (P > 0, 05). ). Tanmateix, la viabilitat cel·lular va disminuir significativament quan la concentració de norwogonina es va augmentar a 1 × 10-4 mol/L (P <0, 05).="" els="" resultats="" van="" indicar="" que="" la="" norwogonina="" no="" presentava="" toxicitat="" ni="" activitat="" proliferativa="" a="" les="" cèl·lules="" pc12="" a="" concentracions="" d'1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−5="">

A continuació, vam examinar l'efecte protector de la norwogonina contra lesions de cèl·lules PC12 induïdes per la hipòxia. Com es mostra a la figura 2b, en comparació amb el grup control, la viabilitat cel·lular del grup d'hipòxia es va reduir al 58,71 per cent (P <0.01). en="" comparació="" amb="" el="" tractament="" amb="" hipòxia,="" pretractat="" amb="" 1="" ×="" 10−="" 8,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" i="" 1="" ×="" 1{0−="" 6="" mol/l="" norwogonina="" protegida="" depenent="" de="" la="" dosi="" pc12="" cèl·lules="" contra="" lesions="" induïdes="" per="" la="" hipòxia,="" recuperant="" la="" viabilitat="" cel·lular="" del="" 58,71="" al="" 62,79%="" (p=""><0,05), 66,68%="" (p=""><0,01) i="" 69,88%="" (p=""><0,01), respectivament.="" el="" pretractament="" amb="" rutina="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" també="" va="" mostrar="" un="" efecte="" protector,="" augmentant="" significativament="" la="" viabilitat="" cel·lular="" fins="" al="" 63,="" 78="" per="" cent="" en="" comparació="" amb="" el="" tractament="" amb="" hipòxia.="" la="" viabilitat="" pretractada="" amb="" norwogonina="" 1="" ×="" 10−5="" mol/l="" es="" va="" reduir="" al="" 63,43="" per="" cent,="" que="" encara="" és="" significativament="" superior="" a="" la="" del="" grup="" d'hipòxia="" (p=""><0,05). aquests="" resultats="" van="" demostrar="" que="" la="" norwogonina="" mostrava="" una="" citoprotecció="" significativa="" a="" les="" concentracions="" d'1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" i="" la="" concentració="" més="" efectiva="" és="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" aleshores,="" aquesta="" dosi="" es="" va="" utilitzar="" com="" a="" dosi="" òptima="" en="" els="" experiments="">

La capacitat protectora de la norwogonina també es va comprovar mitjançant alteracions morfològiques. Com es mostra a la figura 2c, les cèl·lules PC12 sense tractament amb hipòxia van créixer bé amb formes regulars (fusiformes), mides uniformes. Després de l'exposició a la hipòxia, les cèl·lules PC12 van mostrar una contracció, una forma arrodonida, descamació i una densitat cel·lular reduïda. Les cèl·lules pretractades amb norwogonina o rutina abans de l'exposició a la hipòxia van créixer millor, el nombre de cèl·lules de descamació va disminuir i la forma cel·lular es va recuperar amb normalitat. A més, la capacitat protectora de la norwogonina es va confirmar per la fuita de LDH, que s'associa amb la pèrdua de la integritat de la membrana cel·lular. Tal com es mostra a la figura 2d, l'activitat de LDH al medi de cultiu va augmentar notablement després de l'exposició a la hipòxia (P <>

El pretractament amb norwogonina o rutina va disminuir dràsticament la fuita de LDH, cosa que suggereix que la norwogonina i la rutina van restaurar la integritat de la membrana cel·lular. Norwogonin inhibeix l'estrès oxidant induït per la hipòxia a les cèl·lules PC12. ROS i MDA són dos indicadors importants de l'estrès oxidant cel·lular induït per la hipòxia. Com es mostra a les figures 3a i b, es va observar un augment significatiu del contingut de ROS i MDA a les cèl·lules PC12 després de l'exposició a la hipòxia. El pretractament amb norwogonina o rutina va inhibir significativament la producció de ROS i MDA.

Els enzims antioxidants, com SOD, CAT i GPx, es consideren el principal sistema de defensa contra l'estrès oxidatiu a les cèl·lules. Com es mostra a la figura 3c-e, l'exposició a la hipòxia va inhibir significativament les activitats de SOD, CAT i GPx a les cèl·lules PC12. El tractament amb norwogonina o rutina va revertir aquests canvis i va restaurar l'activitat dels enzims antioxidants. Tots aquests resultats van indicar que la norwogonina va protegir les cèl·lules PC12 contra l'estrès oxidatiu induït per la hipòxia.