Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Si us plau, feu clic aquí per a la part 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4* i Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Institut de Grau de Medicina Regenerativa Neural, Facultat de Ciència i Tecnologia Mèdiques, Universitat Mèdica de Taipei, Taipei 11031, Taiwan

2Institut de Biologia Molecular, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3Institut de Medicina Clínica, Facultat de Medicina, Universitat Nacional de Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwan

4Centre de Recerca de Medicina Clínica, Hospital Universitari Nacional Cheng Kung, Facultat de Medicina, Universitat Nacional Cheng Kung, Tainan 70403, Taiwan

5Departament i Institut de Postgrau de Ciències Biomèdiques, Facultat de Medicina, Universitat Chang Gung, Taoyuan 33302, Taiwan

6 Centre de recerca en neurociència, Hospital Memorial Chang Gung, Linkou 33302, Taiwan

7 Contacte principal

*Correspondència: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche pot millorar la memòria

RESUM

La variació fenotípica és un requisit previ fonamental per a l'evolució de cèl·lules i organismes per selecció natural. Mentre que el paper de l'expressió gènica estocàstica en la diversitat fenotípica de cèl·lules genèticament idèntiques està ben estudiat, no se'n sap gaire sobre la relació entre l'expressió gènica estocàstica i la variació del comportament individual en animals. Demostrem que un miRNA específic (miR-466f{-3p) està regulat a l'alça a l'hipocamp d'una part de ratolins endogàmics individuals en una tasca de laberint d'aigua de Morris. Significativament, miR- 466f-3p regula positivament la morfologia, la funció i l'aprenentatge espacial de les neurones, imemòriacapacitat dels ratolins. Mecànicament, miR-466f{-3p reprimeix la traducció de MEF2A, un regulador negatiu de l'aprenentatge/memòria. Finalment, mostrem que la regulació variada del miR-466f{-3p de l'hipocamp resulta de la fosforilació aleatòria de la unió d'elements de resposta d'AMP cíclic (cAMP) de l'hipocamp (CREB) en individus. Aquesta troballa de modulació de l'aprenentatge espacial imemòriamitjançant un eix de senyalització de l'hipocamp aleatoritzat després de l'estimulació neuronal representa una demostració de com la variació en l'expressió gènica dels teixits condueix a un comportament animal variat.

INTRODUCCIÓ

La variació fenotípica entre individus atorga un avantatge evolutiu ja que proporciona la diversitat poblacional sobre la qual actua la selecció natural (Pavlicev et al., 2011). Els antecedents genètics i els factors ambientals contribueixen a generar aquesta variació natural (Bendesky i Bargmann, 2011). Experimentalment, sovint s'han utilitzat ratolins endogàmics per estudiar les bases moleculars i cel·lulars dels fenotips i comportaments mitjans per tal de minimitzar els efectes de les diferències genètiques entre els individus provats (Casellas, 2011). Tanmateix, s'ha demostrat una variació de l'abundància de la transcripció dels teixits entre ratolins isogènics individuals. Els gens que presenten nivells d'expressió molt variables s'associen sovint amb la funció immune, les respostes a l'estrès i la regulació hormonal, és a dir, els processos sensibles a les indicacions ambientals (Vedell et al., 2011). Alguns d'aquests estudis també han demostrat que les diferències en l'expressió gènica o la senyalització cel·lular, amb o sense la influència de factors ambientals com la llepada materna, l'aportació de nutrients a l'úter o la resiliència induïda per l'estrès versus la susceptibilitat (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), pot provocar diferències en fenotips i comportaments (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Aprenentatge espacial imemòriaLa formació controlada pel cervell es pot separar en dos sistemes: (1) navegació egocèntrica que empra l'automoviment i senyals interns i (2) navegació al·locèntrica que implica principalment l'hipocamp i les estructures cerebrals properes que és estimulada per senyals distals fora dels organismes (Ekstrom). et al., 2014). La capacitat d'aprenentatge espacial imemòriapermet a la majoria d'espècies animals ajustar progressivament els seus comportaments per adaptar-se a entorns variables espacialment i temporalment, la qual cosa és fonamental per a la seva supervivència. Això es pot avaluar en animals de laboratori aplicant paradigmes de comportament com el laberint aquàtic Morris (MWM) (Vorhees i Williams, 2014). En particular, s'ha demostrat que els rosegadors endogàmics genèticament idèntics presenten una variació fenotípica en l'aprenentatge espacial imemòria(Tsai et al., 2002), però els mecanismes subjacents d'aquesta variació de comportament romanien desconeguts.

La formació de nous records és un procés complex que requereix transcripció gènica depenent de l'activitat, síntesi de noves proteïnes i

Figura 1. Correlació entre la variació de l'aprenentatge espacial imemòriacapacitat i inducció miR-466f{-3p

(A) Tasca MWM de ratolins C57BL/6J endogàmics de tipus salvatge. Tauler esquerre: actuacions MWM de ratolins GLN (punts) i ratolins PLN (quadrats). D'un total de 289 ratolins provats, 180 es van classificar com a GLN i 109 com a PLN. Tauler dret: prova de la tasca MWM (n=47i 30 a cada grup). A l'histograma es comparen les mitjanes de temps per a cadascun dels quatre quadrants i la regió de la plataforma. P, lloc de la plataforma desapareguda; T, zona objectiu sense P; R, zona dreta; O, zona oposada; L, zona esquerra. (B) Anàlisi RT-qPCR de l'expressió de miRNA. Els nivells d'expressió relatius de sis miRNAs situats dins del clúster miR-466-669 i miR{-132-3p, com a control positiu enriquit en el cervell, es van analitzar i normalitzar amb el control intern U6 snRNA de l'hipocamp del ratolí GLN i PLN. (n=9–18 per grup). jo, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3p.

xarxes neuronals específiques afinades commemòriaengrames per fer noves connexions neuronals i plasticitat sostinguda (Asok et al., 2019). Els engrames de l'hipocamp, que són poblacions escasses de neurones al gir dentat (DG), representen conjunts de neurones que mostren una activitat augmentada desprésmemòriaformació. Tot i que les neurones de l'engrama DG presenten un patró molt diferent d'expressió gènica (Rao-Ruiz et al., 2019), els mecanismes moleculars específics de l'engrama subjacentsmemòriaLa consolidació segueix sent desconeguda. Es coneixen diversos factors i vies de senyalització que regulen positivament o negativament l'aprenentatge imemòrias'han identificat processos (Abraham et al., 2019; Humeau i Choquet, 2019). Entre ells, la forma activada de la proteïna d'unió a l'element de resposta a l'AMPc (cAMP) (CREB) estimula la transcripció gènica en resposta a l'augment de Ca2 intracel·lular més depenent de l'activitat a les neurones (Kandel, 2012). D'altra banda, el camp/PKApathway reprimeix l'activitat transcripcional del factor 2 del potenciador de miocits (MEF2) impedint l'exportació nuclear del seu correpressor, HDAC5, i la importació nuclear del coactivador NFAT (Belfield et al., 2006). A més, a diferència de CREB, l'activitat de MEF2A limitamemòriaformació (Cole et al., 2012). A part dels factors proteics, els microARN (miRNAs) també estan implicats en la regulació de les funcions neuronals, incloent l'aprenentatge i la memòria (McNeill i Van Vactor, 2012). Els miRNA són petits (22 nt) ARN no codificants que actuen principalment reguladors post-transcripcionals de l'expressió gènica mitjançant l'aparellament de bases específiques de seqüències amb els seus llocs de reconeixement a les 30 regions no traduïdes (30 UTR) d'ARNm específics (Daugaard i Hansen, 2017). Els miRNA participen en una sèrie de vies de senyalització a les neurones post-mitòtiques i medien processos cel·lulars que depenen de l'activitat, com ara el creixement i la ramificació dendrítics, la formació de sinapsis i la maduració. Mitjançant la regulació de l'expressió gènica, també juguen un paper important en les formes duradores de plasticitat sinàptica subjacent.memòriaformació, recuperació i consolidació (Chen i Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

A continuació, presentem evidències d'un vincle causatiu entre l'expressió gènica del teixit estocàstic i la variació del comportament individual en animals. En particular, mostrem que l'activació estocàstica d'un eix hipocampal CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A modula la variació individual de l'aprenentatge espacial imemòriacapacitat en ratolins endogàmics.

RESULTATS

Variació individual de l'aprenentatge espacial imemòriala capacitat està correlacionada amb la inducció de miR{-466f{-3p d'un clúster de miRNA específic

Identificar miRNAs implicats en la regulació de l'aprenentatge imemòriaformació, vam utilitzar la tasca MWM per distingir els ratolins C57BL / 6J de tipus salvatge endogàmics amb bona o poca capacitat d'aprenentatge i memòria (figura 1A). Vam definir els ratolins que van completar la tasca en 30 s a l'última sessió (6a) com a "bons aprenents" (GLN), mentre que els ratolins que no van poder trobar la plataforma en 30 s a la darrera sessió es van considerar "aprenents pobres". '(PLN). Tal com es mostra a la figura 1A (tauler esquerre), el 62 per cent dels ratolins pertanyien al grup GLN (180 de 289 ratolins), mostrant una notable reducció de la latència d'escapament de 98,1 s (1a sessió) a 21,8 s (6a sessió). En canvi, la latència d'escapament del 38 per cent restant dels ratolins, el grup PLN (109 de 289 ratolins), només es va reduir moderadament entre la primera i la sisena sessió (de 111,8 s a la primera sessió a 82,1 s a la 6a sessió). . La prova de la sonda, que indica que els ratolins havien après la tasca durant les sis sessions, també va mostrar que els ratolins GLN es van quedar més temps a la regió de la plataforma que els ratolins PLN (figura 1A, parell de barres esquerre al panell dret).

A continuació, vam analitzar els ARN de l'hipocamp de ratolins GLN i PLN mitjançant la hibridació de microarrays de miRNA (n=4 cada grup). En general, vam observar diferències relativament menors en els perfils d'expressió dels miRNAs de l'hipocamp dels ratolins GLN i PLN. Tanmateix, vam observar que els 10 miRNAs principals per als quals els nivells d'expressió eren més alts en ratolins GLN que en ratolins PLN (dades no mostrades) eren tots derivats del mateix clúster de miRNA específic per a rosegadors, miR-466-669, situat a l'intró 10 de el gen mSfmbt2 (vegeu més avall). A partir de l'anàlisi de la reacció en cadena de la polimerasa quantitativa de transcripció inversa (RT-qPCR) dels nivells d'expressió dels miRNA seleccionats al clúster, vam triar miR-466f{-3p per a una investigació posterior (figura 1B). L'expressió mitjana d'aquest miRNA va ser 1.5- vegades més alta a l'hipocamp dels ratolins GLN en comparació amb els ratolins PLN. En particular, els nivells mitjans de miR-466f{{-3p de l'hipocamp eren similars entre el grup PLN, el grup de control de la gàbia domèstica (HC) i el grup de control de natació (figura 1C), excloent així els efectes relacionats amb l'exercici durant nedar i donar suport encara més a la idea que miR-466f{-3p es va induir durant l'aprenentatge espacial imemòriaformació.

A la figura 1C, les dades revelen que els nivells d'expressió de miR-466f{-3p de l'hipocamp de més del 42 per cent dels ratolins GLN eren almenys 1,5- vegades superiors al nivell d'expressió mitjà de Els ratolins de control HC, mentre que els nivells en el 15 per cent dels ratolins PLN eren la meitat dels ratolins HC. Aproximadament el 25 per cent dels ratolins GLN i el 55 per cent dels ratolins PLN tenien nivells similars de miR-466f{{{{0}}p (0.8- a 1.2- plegat respecte a HC). A la figura 1D es presenta un diagrama de dispersió de correlació de Pearson que mostra una correlació positiva entre els nivells de miR-466f{-3p i la durada percentual a la plataforma durant la prova de la sonda. També vam realitzar una hibridació in situ (ISH) de miR-466f{-3p i U6 petit ARN nuclear (ARNs) de les rodanxes de cervell tant en ratolins GLN com en PLN (figura 1E). L'anàlisi estadística dels senyals de miR- 466f{-3p mitjançant ISH va confirmar que la inducció de miR{-466f{- 3p era efectivament més gran en el DG dels ratolins GLN que en el de

Ratolins PLN, mentre que no es va trobar cap diferència quan es van comparar els senyals de snRNA U6 (histograma de la dreta, figura 1E). Tot i que els senyals miR-466-3p no eren iguals entre les cèl·lules de grànuls individuals a DG, encara van augmentar de manera significativa i ubiqua a l'hipocamp dels ratolins GLN en comparació amb els ratolins PLN. Per tant, la inducció miR-466f{-3p no es va produir només en una petita porció de cèl·lules, per exemple, les neurones de l'engrama. Aquestes dades indiquen que la regulació a l'alça de miR-466f{-3p durant la tasca MWM està estretament associada amb un millor aprenentatge espacial imemòriacapacitat entre una proporció significativa de ratolins GLN.

També es van analitzar els nivells d'expressió mitjans de diversos miRNAs específics del cervell mitjançant RT-qPCR. Entre ells, miR-132-3p es va regular a l'hipocamp del ratolí després de la tasca MWM, però no vam observar diferències significatives entre els grups GLN i PLN (parell de barres VII, figura 1B). Els nivells d'expressió de miR-335-5p i miR{-22 eren similars entre els grups GLN, PLN i HC (figura S1A). Així, a diferència de miR-466f{-3p, l'expressió hipocampal d'aquests miRNA durant l'entrenament MWM no està correlacionada amb l'aprenentatge espacial imemòriacapacitat dels ratolins.

La regulació a l'alça de miR-466f{-3p promou el creixement de neurites i la formació de la columna dendrítica

Per confirmar que miR-466f{-3p es va expressar efectivament a les neurones, vam realitzar miRNA ISH combinat amb una tinció d'immunofluorescència (IF) de NeuN i MAP2 a les neurones de l'hipocamp primàries. Els resultats van mostrar que, de manera similar a altres miRNAs (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f{-3p es va expressar principalment a la regió del soma neuronal, amb alguns senyals addicionals. a les dendrites (Figura S2A). Entendre les bases moleculars i cel·lulars de l'associació de miR-466f{-3p regulada amb l'aprenentatge imemòriaformació, primer vam sobreexpressar de manera transitòria miR-466f{-3p juntament amb un polipèptid de fusió dsRed sota el control del promotor de la ubiquitina del pFUGW-miR-466f{-3p- Plasmidi dsRed a les neurones de l'hipocamp primàries DIV10 (figura S2B). Mitjançant miRNA ISH, vam confirmar que el senyal miR-466f{-3p és més fort al grup de sobreexpressió miR{{-466f{-3p en relació amb el control vectorial o miR{{ mutant. 12}}f-3grup p (fletxes, figura S2B). Paral·lelament, també vam establir una plataforma per examinar l'efecte de la pèrdua de funció miR{-466f{-3p per inhibició de miR{-466f{-3p mitjançant l'esponja miR situada a el 30 UTR d'ARNm d'EGFP expressat a partir del plasmidi pFUGW-miR-sponge-EGFP (figura S2C). El reporter EGFP al plasmidi d'esponja va servir tant d'indicador de l'eficiència de transfecció com de sensor de l'activitat cel·lular de miRNA (Kluiver et al., 2012). En una part significativa de les cèl·lules HEK293T transfectades, el senyal EGFP va disminuir en coexpressió amb miR-466f{-3p de tipus salvatge, però no amb miR-466f{{32 mutant. }}p, a causa de la inhibició de la traducció de l'ARNm d'EGFP mitjançant la unió de miR-466f{-3p a l'esponja miR- en el 30 UTR (compareu les quatre imatges de l'esquerra i les dues his- programa, figura S2C) . En canvi, no vam observar una disminució del senyal EGFP en coexpressió de l'esponja de control que codificava vuit còpies d'una seqüència remenada del plasmidi pFUGW-SCR-sponge-EGFP amb miR-466f{-3p o el seu mutant (compareu les quatre imatges correctes i dos histogrames).

Tal com es mostra a la figura 2A, l'expressió ectòpica de miR-466f{-3p va donar lloc a canvis morfològics de les neurones, sobretot la millora del creixement de neurites en relació amb les neurones de control transfectades amb el vector pFUGW- que expressa dsRed. dsRed o plasmidi mutant miR{-466f{-3p-expressing pFUGW-mut-miR{- 466f{-3p-dsRed. Les dades de quantificació van mostrar que el nombre mitjà de branques dendrítiques per neurona no era significativament diferent entre el grup que sobreexpressa miR{-466f{{-3p (barra II) i el control vectorial o mutant (barras I i III) (dreta). histograma superior, figura 2A). Tanmateix, la longitud mitjana total de les dendrites i la longitud mitjana de les dendrites primàries van augmentar amb la sobreexpressió de miR-466f{-3p (compareu la barra II amb les barres I i III, histograma inferior dret de la figura 2A). Paral·lelament, vam inhibir la miR-466f{-3p endògena mitjançant l'esponja miR. Com s'ha vist, no hi va haver cap diferència significativa en el nombre de branques dendrítiques entre els grups d'inhibició de miR-466f{{-3p i control (compareu la barra IV amb les barres I i V, histograma superior dret, figura 2A) , però el grup d'inhibició de miR-466f{-3p va mostrar una reducció notable de la longitud total mitjana de les dendrites, així com de les longituds mitjanes de les dendrites primàries i secundàries en relació amb altres grups (compareu la barra IV amb les barres I i V, histograma inferior dret de la figura 2A). A més, la tinció d'IF va demostrar que la sobreexpressió de miR- 466f{-3p, però no la inhibició, també va augmentar la densitat de les espines dendrítiques (figura 2B, panells superiors i histograma inferior esquerre). També vam realitzar una tinció conjunta per a la proteïna de densitat postsinàptica 95 (PSD-95) i vam comptar la densitat d'espines dendrítiques colocalitzades per establir el nombre exacte de sinapsis excitatòries (figura 2B, histograma inferior dret), que va revelar que miR{{40} La sobreexpressió de }}f-3p va augmentar la densitat d'espines positives de PSD-95-en comparació amb altres grups de control. No obstant això, la inhibició de miR-466f{-3p no va alterar significativament la densitat de les espines positives de PSD-95- respecte a la dels grups de control (figura 2B, histograma inferior dret). En conjunt, aquestes dades indiquen que, en absència d'estimulació neuronal, la inhibició de miR-466f{-3p per si sola no afecta les densitats de les sinapsis excitadores o les espines dendrítiques totals.