Part 1: Verbascoside protegeix les cèl·lules pancreàtiques contra l'estrès d'ER
Mar 05, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, més , Paola Marciani 1, més , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 i Carla Perego 1,*
Resum:
L'evidència epidemiològica substancial indica que una dieta rica en polifenols protegeix contra el desenvolupament de diabetis tipus 2. El glucòsid feniletanoideverbascoside/acteòside, un compost vegetal polifenòlic molt estès, té diverses propietats biològiques, com ara fortes activitats antioxidants, antiinflamatòries i neuroprotectores. L'objectiu d'aquesta investigació era provar els possibles efectes deverbascosida les cèl·lules pancreàtiques, un objectiu mai provat abans. Es van incubar amb cèl·lules humanes i de ratolíverbascosid(0.8-16 uM) durant un màxim de cinc dies i es va utilitzar una combinació de tècniques bioquímiques i d'imatge per avaluar la supervivència i la funció cel·lular en condicions normals o induïdores d'estrès del reticle endoplasmàtic (ER). Hem trobat un efecte protector depenent de la dosiverbascosidcontra l'estrès oxidatiu en cèl·lules clonals i humanes. Els estudis mecanicistes van revelar que el polifenol protegeix les cèl·lules contra les disfuncions mediades per l'estrès ER, modulant l'activació de la branca de la proteïna quinasa semblant a l'ARN del reticle endoplasmàtic quinasa (PERK) de la resposta proteica desplegada i promovent la dinàmica mitocondrial. Com a resultat, es va detectar una major viabilitat, funció mitocondrial i contingut d'insulina en aquestes cèl·lules. Aquests estudis proporcionen l'evidència queverbascosidaugmenta la capacitat de les cèl·lules - per fer front a l'estrès ER, un contribuent important de la disfunció i el fracàs de les cèl·lules - en condicions de diabetis i dóna suport al potencial terapèutic del verbascòsid en la diabetis.
Paraules clau:
verbascosid; polifenols; cèl·lules productores d'insulina; diabetis; UPR; estrès oxidatiu; ER-estrès; PERK; antiinflamatori; mitocondris
1. Introducció
La diabetis és un trastorn crònic que afecta centenars de milions de persones [1]. Una etiologia diferent caracteritza la diabetis tipus 1 (T1D) i la diabetis tipus 2 (T2D), ambdues amb manca d'insulina [2]. La insulina regula la concentració de glucosa plasmàtica estimulant la captació de glucosa a les cèl·lules musculars i grasses i modulant el metabolisme de la glucosa en el fetge. La disponibilitat de nutrients, les hormones i les entrades neuronals regulen la secreció d'insulina pancreàtica i mantenen les concentracions de glucosa en sang dins d'un rang fisiològic [3–5]. Per tant, la disfunció cel·lular condueix a una diabetis caracteritzada per una hiperglucèmia en dejú.
La T2D és una condició progressiva en la qual la resistència a la insulina i el mal funcionament de les cèl·lules estan relacionades entre si i l'evidència recent va augmentar l'interès pel paper principal crític de les cèl·lules en l'estat d'hiperglucèmia [6,7]. En subjectes obesos no diabètics, les cèl·lules compensen la resistència a la insulina amb un augment de la secreció de l'hormona. No obstant això, en alguns subjectes, a mesura que les seves condicions es empitjoren, la insulinèmia baixa i el nivell de glucosa augmenta fins a la hiperglucèmia [8,9].
La glucosa és el modulador més important de les funcions cel·lulars. L'estimulació de la glucosa afecta la regulació dels gens i l'expressió de proteïnes implicades en moltes funcions cel·lulars com la glucòlisi, la síntesi i la secreció d'insulina [10]. La secreció d'insulina induïda per la glucosa depèn del metabolisme oxidatiu per produir adenosina trifosfat (ATP) i es produeix fisiològicament un baix nivell d'espècies reactives d'oxigen (ROS). Tanmateix, les cèl·lules - no estan molt ben equipades amb enzims carronyaires i aquesta debilitat les fa molt susceptibles a l'estrès oxidatiu [11,12]. A mesura que augmenta l'estrès oxidatiu, la producció d'insulina de les cèl·lules disminueix i les cèl·lules produeixen citocines que encenen el dany cel·lular mitjançant la inflamació i l'apoptosi [13]. Curiosament, encara que la massa cel·lular reduïda s'ha atribuït prèviament a la mort cel·lular, estudis recents suggereixen un paper important de la desdiferenciació cel·lular [14,15]. Ha quedat clar que diverses etapes condueixen a T2D. Els insults metabòlics i oxidatius causen estrès al reticle endoplasmàtic (RE) que condueix a una disminució de la síntesi i secreció d'insulina, els processos d'inflammació segueixen l'alliberament de citocines i la pèrdua de cèl·lules es pot produir per apoptosi i desdiferenciació. Aquest coneixement és fonamental per desenvolupar estratègies de tractament adequades, ja que l'estrès oxidatiu i la inflamació es poden contrarestar, i la plasticitat de les cèl·lules pancreàtiques permet la possibilitat de revertir les cèl·lules mare a cèl·lules - com s'ha demostrat en ratolins [16].
Recentment, la vulnerabilitat de les cèl·lules -a l'estrès oxidatiu ha impulsat amb èxit l'ús d'antioxidants dietètics per prevenir la diabetis [17]. Entre els aliments antioxidants més interessants, l'oli d'oliva és conegut per les seves propietats beneficioses des dels antics grecs. L'oli d'oliva conté una bona quantitat d'àcids grassos monoinsaturats (MUFA) i diversos polifenols com tirosol, hidroxitirosol, oleuropeïna i verbascòsid.
Verbascoside, també conegut com acteòsid, és un glicòsid feniletanoide extret d'Olea europea, plantes de l'espècie Verbascum i 23 famílies de plantes més [18–20]. També es pot obtenir a partir de subproductes de l'oli d'oliva (s'enriqueix amb aigües residuals de molins d'oliva derivades del processament de fruites d'oliva) o es pot produir mitjançant enfocaments d'enginyeria metabòlica i biologia sintètica [21].
Encara no s'han informat dades sobre la biodisponibilitat del verbascòsid en humans. Els estudis realitzats en ratolins, cèl·lules SKBR3 i Caco-2 suggereixen que pot ser factible que el verbascòsid no metabolitzat travessi la barrera intestinal, circuli pel plasma sanguini i exerceixi efectes antioxidants [20,22,23]. A diferència de la majoria dels polifenols vegetals, el verbascòsid actua principalment sobre les cèl·lules mitjançant la modulació de la transcripció gènica d'una varietat d'enzims i factors reguladors, amb efectes antioxidants i antiinflamatoris [24–30].
Encara que es coneixen molts efectes beneficiosos del verbascòsid per a la salut humana, no hi ha dades sobre el seu efecte sobre les cèl·lules pancreàtiques. Com que l'estrès oxidatiu i la inflamació són a la base de la patogènesi de la T2D, vam investigar si el tractament amb verbascòsid podria millorar la viabilitat de les cèl·lules i
funcionen en condicions induïdores d'estrès ER i vam caracteritzar els mecanismes moleculars de la seva acció. Les nostres dades revelen que el verbascòsid prevé l'estrès oxidatiu i la inflamació de les cèl·lules modulant l'activació de la resposta proteica desplegada i afavorint la dinàmica mitocondrial, augmentant així la viabilitat cel·lular i el contingut d'insulina.
2. Materials i Mètodes
2.1. Cultiu cel·lular i materials
Les cèl·lules tc3 de ratolí (proporcionades amablement pel Prof. Hanahan—Departament de Bioquímica i Biofísica, Universitat de Califòrnia, San Francisco, CA [31]) es van cultivar en medi RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Itàlia) complementat amb sèrum fetal de vedella inactivat per calor al 10% (v/v) (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Itàlia), 1% (v/v) de penicil·lina-estreptomicina (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Itàlia) i 1 per cent (v/v) de L-glutamina (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Itàlia). Els illots humans de Langerhans es van aïllar a Milà (Niguarda Ca' Granda) de donants multiòrgans cadavèrics segons el procediment descrit per Ricordi et al. [32]; es van cultivar en medi de cultiu RPMI que contenia 5,5 mmol/L de glucosa, un 10% de sèrum fetal boví inactivat per calor, 0,7 mM de glutamina, 50 unitats/mL de penicil·lina i 50 ug/mL d'estreptomicina (EuroClone, SpA, Pero MI, Itàlia). Es van utilitzar quatre preparacions diferents d'illots, la puresa dels illots va ser del 80 ± 10 per cent. L'aïllament i els estudis d'illots van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de l'hospital Niguarda Ca' Granda de Milà (11.12.2009). Les cèl·lules tc3 es van tractar amb 0,8, 1,6 i 16 uM de verbascòsid (Carbosynth, OV08034, Compton, Regne Unit), àcid cafèic i hidroxitirosol (amable regal del Prof. Dell'Agli, Departament de Ciències Farmacològiques i Biomoleculars, Universita degli Studi di Milano, Milà, Itàlia) en medi RPMI complet durant 5 dies, mentre que illots humans amb 16 uM de verbascòsid. Com a controls es van utilitzar cèl·lules tractades amb metanol/etanol. Per tal d'induir l'estrès oxidatiu, les cèl·lules es van tractar amb H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, EUA) 500 uM en medi RPMI complet durant 20 min abans de l'anàlisi, mentre que el tractament amb tunicamicina 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich). ) durant 7 h es va realitzar per induir estrès ER.
2.2. Detecció de la viabilitat cel·lular mitjançant la prova MTT
Les cèl·lules es van sembrar en 96 plaques de diversos pous i cinc dies després del tractament amb verbascòsid es van incubar amb 0,5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol{{7} }il)-2,5-bromur de difeniltetrazoli) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, EUA) durant 4 h en atmosfera humidificada que conté un 5 per cent de CO2 a 37 oC. Després de la incubació, les cèl·lules es van tornar a suspendre suaument en 100 uL de DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Itàlia) i es va detectar l'absorbància a 540 nm amb un lector de microplaques (Benchmark, lector de microplaques, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, EUA) [33]. Els experiments es van realitzar per triplicat i les dades es van expressar com a augment de vegades respecte a les mostres de control.
2.3. Detecció de la mort cel·lular per citometria de flux
Cinc dies després de la incubació amb verbascòsid 16 uM, les cèl·lules - es van separar mitjançant una incubació de 7 min amb tripsina/EDTA, es van recollir i es van centrifugar; el pellet es va tornar a suspendre suaument en sals baixes de solució salina tampó fosfat. Les cèl·lules es van tacar amb el recompte de MuseTM i el reactiu de viabilitat (Millipore, MCH100102, Burlington MA, EUA) seguint el protocol del fabricant i es van analitzar mitjançant citometria de flux. Els experiments es van realitzar per triplicat i les dades es van expressar com a percentatge de cèl·lules mortes sobre el total.
2.4. Generació ROS
Les ROS intracel·lulars es van avaluar amb DCFDA (diacetat de 2/,7/-diclorofuoresceïna) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, EUA), una sonda permeable a la membrana que es torna fluorescent quan s'uneix a ROS [34]. Les cèl·lules tc3 es van carregar prèviament amb 15 uM de DCFDA al tampó Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 i 2 mM CaCl2)
suplementat amb glucosa 11 mM durant 1 h a 37 oC. El contingut de ROS es va detectar durant 30 minuts tant en condicions basals com d'estrès amb un lector de microplaques (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Suïssa). Els valors mitjans i les desviacions estàndard es van basar en tres experiments independents.
2.5. Western Blotting
Les cèl·lules tc3 es van recollir i solubilitzar en tampó RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 per cent de TERGITOLw NP40, 0,5 per cent de desoxicolat) afegit amb aprotinina (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, EUA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, EUA) i inhibidors de Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, EUA) durant 40 min a 4 oC. La concentració de proteïnes es va determinar mitjançant un assaig de Bradford [35] utilitzant el reactiu de Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, EUA), 30 ug de proteïnes es van resoldre amb un 10% de SDS-PAGE i es van transferir a membranes de nitrocel·lulosa (Millipore, Burlington). MA, EUA). Els anticossos primaris es van aplicar durant 2 h en tampó de bloqueig amb un 5% de llet sense greix o solucions de BSA al 5%; es van utilitzar els anticossos primaris següents: ratolí anti- -actina (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, EUA), ratolí anti-acroleïna (Abcam, ab48501, Cambridge, Regne Unit), ratolí anti-BIP (amable regal del Prof. Borgese Nica, Institut de Neurociència, CNR, Milà, Itàlia), conill anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, EUA), ratolí anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, EUA), conill anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, EUA), ratolí anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, EUA), conill anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, EUA), conill anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, EUA), ovella anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), conill anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, EUA), conill anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc. Inc., 5324, Danvers, MA, EUA) i conill anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, EUA). Els anticossos secundaris conjugats amb HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, EUA) es van utilitzar a una dilució 1:5000. Les proteïnes es van detectar mitjançant el sistema de detecció ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Itàlia) mitjançant el sistema Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Alemanya) i la densitat de banda es va quantificar pel programari Image Studiow Lite (LI). -COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA) [36]. Els experiments es van realitzar per triplicat i les dades es van expressar com a augment de vegades respecte a les mostres de control.
2.6. Potencial de la membrana mitocondrial
Les cèl·lules tc3 i els illots humans de Langerhans es van incubar amb 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milà, Itàlia) o 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde a Srl, Milà, Itàlia) per a 3 730 min, Itàlia. oC; Les intensitats de fluorescència es van detectar amb el lector de microplaques TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em per MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em per MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Männedorf Group, Suïssa). Les cèl·lules es van incubar amb 500 uM d'H2O2 durant 20 min i es va detectar la intensitat de la fluorescència tal com es va descriure anteriorment. Els valors mitjans i les desviacions estàndard es van basar en tres experiments diferents.
2.7. Morfologia i dinàmica mitocondrial
Les cèl·lules tc3 es van carregar prèviament amb MitoSpyw Orange CMTMRos de 100 nM (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milà, Itàlia) en tampó Krebs-Ringer de glucosa 11 mM a 37 oC durant 30 min. Les mostres es van col·locar en una cambra d'imatge i es van fer imatges de camps aleatoris utilitzant el filtre rhodan del microscopi Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Alemanya). Per avaluar la morfologia mitocondrial, es van analitzar els paràmetres següents mitjançant el programari d'anàlisi de partícules ImageJ: àrea (um2), circularitat (4mArea2/Perimeter2) i diàmetre màxim de Feret (um) [37].
Per a experiments de lapse de temps, es van realitzar imatges unicel·lulars a 1 fotograma per segon durant 30 s sota condicions de control o d'estrès oxidatiu. Per mesurar la distància acumulada mitocondrial (um2), primer es van corregir les imatges per al blanqueig fotogràfic, després es van analitzar els vídeos mitjançant un connector Image-Pro Plus existent (seguiment d'objectes) (Media Cybernetics, Rockville, MD, EUA). Fins a dotze
Les cèl·lules es van fotografiar en tres experiments independents i les dades es van presentar com a valors mitjans i desviacions estàndard.
2.8. Secreció d'insulina
Els illots humans aïllats de Langerhans es van sembrar en una placa de 96-pous a una densitat de 20 illots per pou i, després de 5 dies de tractament, es van mesurar el contingut i la secreció d'insulina en basal (3,3 mM de glucosa) i es van estimular (16,7 mM de glucosa). ) condicions mitjançant un immunoassaig ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Suècia).
2.9. Anàlisis estadístics
Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar amb GraphPad Prism 8.0 en rèpliques biològiques independents. Les mitjanes entre dos grups es van avaluar mitjançant la prova t de Student de dues cues i es va prendre un valor p < 0,05="" com="" a="" prova="" de="" significació="" estadística.="" es="" van="" comparar="" les="" mitjanes="" entre="" tres="" o="" més="" grups="" mitjançant="" l'anàlisi="" de="" la="" variància="" (anova),="" seguida="" d'una="" prova="" de="" comparació="" múltiple="" post-hoc="" (tukey).="" el="" test="" estadístic="" utilitzat,="" els="" valors="" de="" p="" exactes="" i="" el="" nombre="" de="" rèpliques="" (n)="" s'indiquen="" a="" les="" llegendes="" individuals="" de="" les="" figures.="" les="" barres="" d'error="" de="" les="" figures="" mostren="" la="" mitjana="" ±="" sd="" o="" la="" mitjana="" ±="" se,="" tal="" com="">
3. Resultats
3.1. El verbascoside millora la viabilitat cel·lular
Com que no hi havia dades sobre l'efecte del verbascòsid a les cèl·lules, vam realitzar la prova MTT per avaluar la viabilitat cel·lular i, tal com es mostra a la figura 1A, es va observar una tendència positiva depenent de la dosi. Per tant, per a estudis posteriors, vam seleccionar la concentració de 16 uM que estadísticament es va demostrar eficaç per millorar la viabilitat de les cèl·lules. Mitjançant citometria de flux vam estudiar l'impacte de cinc dies d'incubació de verbascòsid en la supervivència cel·lular en condicions basals i després de 2{{21} } min de pretractament amb 500 uM H2O2. En la condició basal, el verbascòsid no va afectar la supervivència cel·lular, cosa que suggereix que l'augment de la viabilitat cel·lular observada en l'assaig MTT pot ser degut a una millora de l'activitat mitocondrial. Mentre que, després de l'exposició a H2O2, el pretractament amb verbascòsid 16 uM va reduir significativament la mort cel·lular induïda per l'estrès oxidatiu (figura 1B, C). El verbascòsid és una molècula complexa que es pot modificar mitjançant la hidrolització d'enzims [18]. Per provar si els metabòlits del verbascòsid podrien ser responsables de l'efecte protector observat, les cèl·lules tc3 es van tractar amb hidroxitirosol i àcids cafèics (0,8 i 16 uM) durant 5 dies. Tots dos metabòlits no van millorar la viabilitat cel·lular, per contra, es va detectar un efecte citotòxic, més rellevant després de l'exposició a H2O2, per a la concentració de 16 uM (Figura S1). Aquesta troballa demostra que el verbascòsid i no els seus metabòlits exerceix l'efecte protector del tractament amb H2O2.
3.2. El verbascòsid modula l'homeòstasi redox i exerceix un efecte antiinflamatori a les cèl·lules
Primer vam confirmar a les cèl·lules tc3 els efectes antiinflamatoris i antioxidants del verbascòsid observats en altres tipus de cèl·lules [24,29,34]. L'activitat d'eliminació de ROS de verbascòsid es va avaluar amb cèl·lules tc3 marcades amb la sonda permeable cel·lular DCFDA específica de ROS (diacetat de 2/,7/-diclorofuoresceïna). Com es mostra a la figura 2A, es va detectar una disminució significativa del contingut de ROS després del pretractament amb verbascòsid, tant en condicions d'estrès basal com oxidatiu.
Les anàlisis de Western blot van revelar una disminució significativa dels marcadors d'estrès oxidatiu acroleïna i l'expressió 4-hidroxinonenal (HNE) a les cèl·lules tractades amb verbascòsid. A més, vam trobar un augment de l'expressió de superòxid dismutasa (SOD1), cosa que suggereix que el verbascòsid exerceix la seva activitat antioxidant probablement amb dos mecanismes diferents, directament com a eliminador de ROS i indirectament induint l'expressió d'enzims antioxidants (Figura 2B, C).
L'efecte antiinflamatori del verbascòsid sobre les cèl·lules es va avaluar mitjançant l'avaluació de l'activació de la via NFKB, la via proinflamatòria més important d'aquestes cèl·lules [38]. Mitjançant l'anàlisi de western blot vam trobar una expressió reduïda d'inhibidor del factor nuclear kappa B (IKB) i del factor nuclear kappa-light-chain-enhancer (NFKB) i una disminució significativa de la fosforilació de NFKB en cèl·lules pretractades, donant suport a la hipòtesi de l'efectivitat del verbascòsid per reduir la inflamació cel·lular (figura 2D, E).
3.3. El verbascòsid modula la resposta proteica desplegada de les cèl·lules -
A continuació, vam analitzar en profunditat el mecanisme molecular pel qual el verbascòsid exerceix funcions antioxidants i antiinflamatòries, centrant-nos en el reticle endoplasmàtic que està emergint com un sensor clau de senyals metabòliques i d'estrès a les cèl·lules. En condicions d'estrès, l'orgànul munta una resposta homeostàtica, coneguda com a resposta proteica desplegada (UPR), dirigida a recuperar la funció ER; tanmateix, l'activació excessiva d'aquesta via provoca apoptosi [39,40].
Els marcadors d'augment de l'estrès ER són la regulació a l'alça de les proteïnes de les chaperones i l'activació de la resposta UPR. L'anàlisi de Western Blotting de cèl·lules tractades amb verbascòsid va revelar nivells reduïts de les dues chaperonines proteïnes de xoc tèrmic 70 (HSP70) i proteïnes d'immunoglobulina d'unió (BIP) (figura 3A, B). A més, es va detectar una reducció significativa de l'expressió de la proteïna quinasa ARN-like ER kinase (PERK) i una disminució de la fosforilació del seu efector aigües avall, el factor d'iniciació de la traducció eucariota 2 (eIF2).
