Part 2: efectes antiinflamatoris, antioxidants, hidratants i antimelanogènesi de la quercetina 3-O{- -D-glucurònit en queratinòcits humans i cèl·lules de melanoma mitjançant l'activació de les vies NF-κB i AP-1

Per a més detalls, contacteutina.xiang@wecistanche.com

Feu clic a l'enllaç per aprendre la part 1:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118257.html

3. Discussió

En els estudis publicats anteriorment, Q-3-G s'ha utilitzat per inhibir l'edema de l'oïda, la permeabilitat peritoneal i l'edema pulmonar [50], actuant com un potentantioxidanten plasma sanguini amb lipoproteïnes de baixa densitat [42], disminuint la modificació oxidativa induïda pel peroxinitrit [51], exercint unaantiinflamatoriefecte inhibint les vies de senyalització JNK i ERK sota el repte LPS [52] i posseir propietats anticancerígenes contra cèl·lules de càncer de mama [56]. Tanmateix, a diferència del seu compost principal àmpliament estudiat,quercetina, els beneficis farmacològics i els mecanismes de Q-3-G encara s'han d'explorar. Segons el que sabem, el paper de Q-3-G en els efectes protectors de la pell no s'ha dilucidat del tot. En aquest estudi, utilitzant diverses avaluacions in vitro, ens vam centrar a caracteritzar els efectes protectors de la pell de Q-3-G contra l'estrès oxidatiu i la inflamació induïts per UVBor H2O2, la hidratació de la pell en HaCaT (una línia cel·lular de queratinòcits humans) iantimelanogènesiactivitat a B16F10 (una línia cel·lular de melanoma murí).

La viabilitat de les cèl·lules HaCaT, B16F10 i HEK293T es va determinar després del tractament amb Q-3-G en un rang de concentracions no citotòxiques. Els resultats van mostrar que no hi havia una inhibició significativa de la viabilitat cel·lular a les cèl·lules HaCaT, B16F10 i HEK293T sobre concentracions de Q-3-Gup fins a 20 μM (figures 2a, 3a i 4f). Es va trobar que la viabilitat cel·lular a les cèl·lules HaCaT, B16F10 i HEK293T a concentracions d'O-3-G fins a 20 μM era inferior a la concentració de quercetina quan s'utilitza per investigar els efectes citotòxics en SCC{{18} } i cèl·lules HSC-6 (50 μM)【57】o viabilitat de l'esperma （50-100μM）【58】. Tanmateix, es va demostrar que Q-3-G era molt menys tòxic en comparació amb la seva aglicona [59]. La manca d'un grup OH lliure a la posició de tres pot contribuir a l'efecte menys tòxic de Q-3-G [29].

Els raigs UVB amb una longitud d'ona de 280-315 nm penetren a la capa superior de la pell i són més efectius que els UVA i els UVC[60]. Els raigs UVB són el motiu de la majoria dels càncers de pell i la mort cel·lular. A més, s'ha demostrat que el dany cel·lular a les cèl·lules HaCaT és induït per la irradiació UVB [61]. En conseqüència, vam investigar la viabilitat cel·lular de les cèl·lules HaCaT després de la irradiació UVB en comparació amb el tractament Q-3-G. Com es mostra en informes anteriors, un dels principals factors que condueixen a cèl·lules, teixits i òrgans danyats és l'exposició a UVB [62,63]. Q-3-G va restaurar la disminució de la viabilitat cel·lular induïda per la irradiació UVB (figura 2b-d). Es demostra que els resultats són similars a l'estudi anterior sobre l'efecte i el mecanisme sobre la citotoxicitat induïda per UVB en HaCaT de quercetina [64].

Feu clic a ella per obtenir més informació sobre els productes

Diversos estudis han descrit que els UVB poden promoure respostes inflamatòries greus, donant lloc a problemes a la pell [1,2,4,27].La UVB activa enzims proinflamatoris importants com la COX-2 i citocines com el TNF-. La COX-2 és un enzim associat a la inflamació que es desencadena per citocines i mediadors proinflamatoris [65], que estimula la resposta inflamatòria. Com que la COX-2 produeix el mediador inflamatori PGE-2, indueix una resposta inflamatòria [66,67], i el TNF- és la citocina proinflamatòria principal [68] en les respostes inflamatòries. Aquestes respostes inflamatòries causen danys a la pell, que provoca l'envelliment de la pell [69]. Els nivells d'expressió d'ARNm de l'enzim inflamatori COX-2 i les citocines proinflamatòries TNF- van ser inhibits per Q-3-G (figura 2e). Segons un resultat publicat anteriorment, la quercetina també va disminuir l'expressió gènica i la producció de TNF- [70]. Pel que fa a les propietats antioxidants, els assaigs d'eliminació de radicals DPPH i ABTS són mètodes ràpids, fiables i reproduïbles per avaluar el in vitro.activitat antioxidantde compostos purs i extractes de plantes [54] i s'han utilitzat àmpliament en mètodes comuns per investigar les activitats d'eliminació de compostos o extractes naturals [1,46,71,72]. S'ha trobat que Q-3-G redueix la reactivitat dels radicals tant en assajos com en citometria de flux de maneres dependents de la concentració. Aquests resultats estan d'acord amb un estudi publicat anteriorment, en què Q-3-G va inhibir significativament la formació de ROS a les cèl·lules PC-12 del feocromocitoma [34]. A més d'actuar químicament amb un efecte antioxidant, vam demostrar que Q-3-G augmentava el nivell de Nrf2, un dels reguladors importants de l'estrès oxidatiu a les cèl·lules. S'ha informat que diversos compostos o extractes naturals posseeixen propietats antioxidants mitjançant la senyalització ARE depenent de Nrf2-[46,73,74]. En conjunt, aquestes troballes indiquen que Q-3-G posseeix activitat antioxidant (figura 2g-j). El melanosoma de la síntesi de melanina es produeix als orgànuls intracel·lulars [75-77]. La sobreproducció de melanina pot afectar l'aspecte de la pell i les malalties de la pell relacionades amb la hiperpigmentació. Hem trobat que el tractament amb O-3-G a les cèl·lules B16F10 induïdes per c -MSH inhibeix la secreció de melanina. Com en treballs anteriors, la melanogènesi intracel·lular també està controlada pels metabòlits de la quercetina i alguns -3-O- -D-glucopiranòsids de quercetina [24,78,79].

Mantenir una pell sana requereix una hidratació adequada de la pell, i els NMF i l'HA tenen un paper important en aquest procés [12]. FLG és un constituent de la barrera cutània, de manera que l'augment del nivell d'expressió de FLG pot estar associat a la hidratació [80]. En el nostre estudi, es va trobar que Q-3-G afectava l'activitat de retenció d'humitat de la pell augmentant FLG i TGM-1 (figura 3c, d). Els nivells d'expressió de FLG i TGM-1 van ser bloquejats pels inhibidors JNK, IKK i IkBain (SP600125 i Bay11-7082, respectivament). Ens vam centrar en els enzims relacionats amb MAPK perquè els nostres estudis tenien com a objectiu determinar els mecanismes moleculars pels quals Q-3-Gex exerceix els seus efectes protectors de la pell. JNK té un paper important en l'apoptosi de queratinòcits induïda per l'estrès oxidatiu [81]. La fosforilació de c-Jun, TAK1, MKK4 i INK va augmentar amb Q-3-G. A més, el retinol no va augmentar significativament la fosforilació de c-Jun, TAK1, MKK4 o JNK, cosa que suggereix que hi ha algunes diferències en les característiques inhibidores entre Q-3-G i retinol en la senyalització AP-1. camí. Com en els resultats publicats anteriorment, la via JNK-c-Jun/AP-1 està correlacionada amb l'efecte anti-apoptòtic dequercetina[82]. En comparació amb l'estudi anterior [83], mitjançant la regulació de les vies de senyalització NF-kB i AP-1, també es va trobar que aquestes vies estaven implicades en el mecanisme subjacent de la quercetina. D'acord amb el mecanisme del seu compost pare, els nostres resultats mostren que la via NF-kB també es va incloure en l'efecte protector de la pell de Q-3-Gaby l'activació de p50, p65, IKK, IkB, Akt i Src. després del tractament amb Q-3-G a les cèl·lules HaCaT. A més, l'activitat de Luc i NF-B-Luc va mediar l'AP-1-Q-3-G (figura 4). Aquestes troballes suggereixen que la senyalització AP-1 i NF-kB mediada per MAPK va contribuir a les propietats protectores de la pell mediades per Q-3-G.

4. Materials i Mètodes

4.1. Materials

Q-3-G es va obtenir de Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). Les cèl·lules HaCaT, HEK293T i B16F10 es van comprar a la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). Sal diamoni ABTS, DPPH, àcid ascòrbic (AA), ABTS i retinol es van comprar a Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO, EUA). El sèrum boví fetal (FBS), el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) i la solució salina tamponada amb fosfat (PBS) es van comprar a Gibco (Grand Island, NY, EUA).3-(4-5-Dimetiltiazol{{ El bromur de 7}}il)-25-difeniltetra-sodi (MTT) es va comprar a Amresco (Brisbane, Austràlia). TRILzol i la premescla de PCR es van comprar a Bio-D Inc. (Seül, Corea). Els kits de síntesi d'ADNc es van comprar a Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). Macrogen, Inc. (Seül, Corea) va sintetitzar encebadors directes i inversos per a PCR (reacció en cadena de la polimerasa). Tots els anticossos relacionats amb les formes fosforilades o totals de la proteïna diana es van comprar a Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA).

4.2.Cultius cel·lulars

Les cèl·lules HaCaT i B16F10 es van cultivar en DMEM amb un 10% de FBS i un 1% d'antibiòtics (estreptomicina i penicil·lina). Les cèl·lules HEK293T es van cultivar en DMEM amb un 5% de FBS i un 1% d'antibiòtics. Aquestes línies cel·lulars es van incubar en un 5% de CO, a 37 graus.

4.3. Proves de viabilitat cel·lular

Les cèl·lules B16F10 es van sembrar a 2 × 10 graus de cèl·lules per pou en plaques 96-pous durant 24 h, se'ls hi va afegir diferents concentracions de Q-3-G (0-20 μM) i després es van incubar durant 48 h. Les cèl·lules HaCaT es van sembrar en plaques 96-pous i les cèl·lules es van sembrar a 6 × 10 graus de cèl·lules/ml. Després d'una nit d'incubació, les cèl·lules es van incubar amb diferents concentracions de Q-3-G （0-20 μM） durant 24 h. Les cèl·lules HEK293T es van sembrar a 6 × 10 graus de cèl·lules/mL en plaques de 96-pous durant 24 h i després es van tractar amb Q-3-G （0-20 μM). Les cèl·lules incubades es van tractar amb 10 μL/pou de solució MTT i, després de 3 h, es van tractar amb 100 μL de solució d'aturada MTT. Utilitzant l'assaig MTT convencional per mesurar la viabilitat cel·lular [84], es va mesurar l'absorbància a 570 nm mitjançant un lector (BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA).

4.4. Anàlisi d'ARNm mitjançant RT-PCR semiquantitativa i PCR quantitativa en temps real

Les cèl·lules HaCaT es van tractar amb Q-3-G（5-30 μM） o retinol (10ug/mL) durant 12 h. L'ARN es va precipitar mitjançant el reactiu TRI tal com es va informar anteriorment [85]. Es va utilitzar un kit de síntesi d'ADNc per sintetitzar l'ADN complementari. La RT-PCR es va dur a terme mitjançant primers específics inversos i directes. Els primers per a RT-PCR i PCR en temps real es mostren a la taula 1.

4.5. Assaig DPPH

Es va utilitzar un assaig de DPPH per avaluar la capacitat d'eliminació de radicals de Q-3-G. Es va utilitzar metanol per dissoldre DPPH a una concentració final de 250 μM. Aleshores, hi havia 475 ml de DPPH

va reaccionar amb 5 ml de Q-3-G (0-40 μM) o AA (500 mM) a 37 graus durant 30 min. El control positiu va ser AA. La determinació de l'efecte d'eliminació de DPPH i el càlcul es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [86].

4.6.Assaig ABTS

Es va realitzar un assaig ABTS tal com es va informar anteriorment [72]. Breument, es van barrejar volums iguals de solució ABTS 7, 4 mM i solució de persulfat de potassi 2, 4 mM i es van mantenir a temperatura ambient durant la nit per generar cations radicals ABTS. Es van afegir solucions ABTS a cada pou de 96-plaques de pou, amb l'addició de Q-3-G (0-40 μM) o AA (500 mM) per pou. Les mescles es van incubar a 37 graus durant 30 min, i després es va mesurar la seva absorbància a 730 nm.

4.7. Assaig de ROS cel·lular per citometria de flux

Per comprovar la formació de ROS intracel·lular, es va utilitzar un colorant sensible a l'oxidació, el diacetat de 2',7'-diclorodihidrofluoresceïna (DCFDA). Les cèl·lules HaCaT es van exposar a UV, i després les cèl·lules es van collir i es van tornar a suspendre amb 300 ul de PBS amb 20 μM de DCFDA durant 30 min a 37 graus a la foscor. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS i es va mesurar la fluorescència a 485/535 nm mitjançant un citòmetre de flux Beckman CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA).

4.8.Anàlisi Western Blot

Les cèl·lules HaCaT es van sembrar a una densitat de 6 × 10 graus cèl·lules/mL. Després de la incubació durant la nit, es van afegir diferents concentracions de Q-3-G (0-10 μM) o retinol (10 ug/mL) i es van incubar més durant 24 h. La preparació de proteïnes i els lisats de cèl·lules senceres es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [87]. Es van utilitzar anticossos específics per detectar la forma total i la forma fosforilada de Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src i Akt, que es van visualitzar amb reactius de quimioluminescència [88].

4.9. Anàlisi de contingut i secreció de melanina

Les cèl·lules B16F10 es van sembrar a una densitat de 2 × 10 graus cèl·lules/ml en plaques 12-pous i es van incubar durant la nit. El medi de cultiu es va canviar per mitjà fresc suplementat amb Q-3-G (10-20 μM) o arbutina (1 mM). La producció de melanina es va estimular amb a-MSH (100 nM) durant 48 h. Per a l'assaig de secreció de melanina, es va mesurar la densitat òptica a 475 nm. Després, es van recollir les cèl·lules per determinar el contingut de melanina intracel·lular, utilitzant un tampó de lisi per lisar les cèl·lules i sedimentar-les per centrifugació (12, 000 rpm, 5 min). Els pellets de cèl·lules concentrades es van dissoldre en 100 ml de tampó de dissolució (1 M NaOH, 10 per cent de DMSO) i es van fondre a 55 graus. L'absorbància es va mesurar a 405 nm mitjançant un lector de densitat òptica [89].

4.10. Irradiació UVB

Les cèl·lules HaCaT es van sembrar a una densitat d'1 × 105 cèl·lules/ml en plaques de 6-pous mitjançant MEM sense sèrum i es van sotmetre a 24 h de fam. Les cèl·lules HaCaT es van tractar prèviament amb G-3-Q durant 30 min i després amb irradiació UVB. A continuació, es van rentar les cèl·lules HaCaT amb PBS i es van exposar a la irradiació UVB (UVBLamp BLX -312, Vilber Lourmat, França). L'energia de la irradiació UVB era de 30 mJ/cm2²【90】.

4.11.H2O2 Tractament

Les cèl·lules HaCaT es van sembrar en plaques de 6-pous i es van sotmetre a 24 h de fam mitjançant MEM sense sèrum. Les cèl·lules es van pretractar amb diferents concentracions de Q-3-G（5-10 μM i després de 30 min es van incubar amb H2O2 (500 μM) durant 12 h.

4.12. Assaig del gen del reporter de la luciferasa

Les cèl·lules HEK293T es van sembrar a una densitat de 3 × 10 graus de cèl·lules/ml en plaques de 24-pous. Les cèl·lules HEK293T es van transferir amb 2 ug de plasmidis que contenien AP-1-Luc o NF-kB-Luc i b-galactosidasa, utilitzant polietilenimina[91]. Després de 24 h d'incubació, les cèl·lules es van tractar amb Q-3-G (5-10 μM) o retinol (10 ug/mL) durant 24 h més. L'assaig de luciferasa es va realitzar mitjançant un luminòmetre a l'absorbància de cada mostra es va mesurar a 475 nm mitjançant un lector de microplaques Spectramax 250 (Molecular Devices, San Jose, CA, EUA), tal com es va informar anteriorment [92].

4.13. Tir de la morfologia cel·lular

Les cèl·lules HaCaT es van sembrar en plaques de 6-pous amb una densitat cel·lular d'1 × 10 graus de cèl·lules/ml. Les cèl·lules HaCaT es van tractar amb G-3-Q durant 30 minuts i després amb irradiació UVB. Després de 24 h, es van fer fotos amb l'objectiu de microscopi, 4×, 10× i 20× (Olympus, Tòquio, Japó).

4.14. Anàlisi estadística

Totes les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard d'almenys tres experiments independents. La prova de Mann-Whitney i la prova t de Student es van utilitzar per comparar diferències estadístiques entre grups. Un valor p<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Conclusions

La nostra investigació va demostrar que les activitats antiinflamatòries i antioxidants Q-3-Gexhibites protegeixen contra factors d'estrès oxidatiu i inflamació sota la irradiació UVB i l'exposició a H2O. També vam demostrar que la Q-3-G té una capacitat estimulant la crema hidratant a les cèl·lules HaCaT. A més de l'efecte antimelanogènesi de Q-3-G, es va demostrar que inhibeix la secreció de melanina en B16F10 induït per -MSH. Finalment, l'efecte de Q-3-G va ser mediat per l'activació de les vies de senyalització AP{-1 i NF-kB. Les activitats protectores de la pell de Q-3-G en cèl·lules de queratinòcits humans HaCaT i cèl·lules de melanoma murí B16F10 es resumeixen a la figura 5. Aquest estudi va establir que Q{-3-G podria ser eficaç a causa del seu antiinflamatori, propietats antioxidants, hidratants i antimelanogènesis en queratinòcits humans i cèl·lules de melanoma mitjançant l'activació de les vies NF-kB i AP{20}}. En conclusió, els resultats indiquen clarament que aquest metabòlit conjugat té el potencial de protegir les cèl·lules de la pell. Es necessiten més investigacions per validar l'efecte de Q-3-G en diversos models in vivo, especialment en relació als models de protecció de la pell.

Referències

1. Kim, E.; Hwang, K.; Lee, J.; Han, SY; Kim, E.-M.; Park, J.; Cho, JY Efecte protector de la pell del galat d'epigalocatequina. Int. J. Mol. Ciència. 2018, 19, 173. [CrossRef]

2. Draelos, ZD Nous tractaments per a la restauració de la permeabilitat de la barrera epidèrmica deteriorada: cremes reparadores de barrera cutània. Clin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, AT; Zmijewski, MA; Zbytek, B.; Tobin, DJ; Theoharides, TC; Rivier, J. Paper clau del CRF en el sistema de resposta a l'estrès de la pell. Endocr. Rev. 2013, 34, 827–884. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Scott, T. La radiació UV i la pell. Int. J. Mol. Ciència. 2013, 14, 12222–12248. [Ref creuat]

5. Rittie, L.; Fisher, cascades de senyal induïdes per llum UV GJ i envelliment de la pell. Envelliment Res. Rev. 2002, 1, 705–720. [Ref creuat]

6. Videira, IF; Moura, DF; Magina, S. Mecanismes reguladors de la melanogènesi. An. sostenidors. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [CrossRef] [PubMed]

7. Che, DN; Xie, GH; Cho, BO; Shin, JY; Kang, HJ; Jang, SI Efectes protectors de l'extracte de tija de raïm contra els danys induïts per UVB a la pell de ratolins C57BL. J. Photochem. Fotobiol. B 2017, 173, 551–559. [Ref creuat]

8. Jeong, D.; Lee, J.; Jeong, SG; Hong, YH; Jo, S.; Han, SY; Kim, JH; Kim, S.; Kim, JS; Chung, YS; et al. L'extracte d'etanol d'Artemisia Asiatica presenta activitat anti-fotoenvelliment. J. Etnofarmacol. 2018, 220, 57–66. [Ref creuat]

9. McDaniel, D.; Farris, P.; Valacchi, G. Envelliment atmosfèric de la pell-Contributors i inhibidors. J. Cosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [Ref creuat]

10. Rao, CV; Pal, S.; Mohammed, A.; Farooqui, M.; Doescher, diputat; Asch, AS; Yamada, HY Efectes biològics i conseqüències epidemiològiques de l'exposició a l'arsènic i reactius que poden millorar el dany de l'arsènic in vivo. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Sinha, K.; Das, J.; Pal, PB; Sil, PC Estrès oxidatiu: les vies de l'apoptosi dependents dels mitocondris i independents dels mitocondris. Arc. Toxicol. 2013, 87, 1157–1180. [Ref creuat]