Tercera part DsbA-L interacciona amb VDAC1 en l'apoptosi de cèl·lules tubulars mediada per mitocondris i contribueix a la progressió de la malaltia renal aguda

7. La generació de ratolins PT-VDAC1-KO

Per investigar el paper de VDAC1 en AKI, vam establir un model de ratolí que presentava la eliminació de VDAC1 als túbuls proximals dels ronyons. La figura 7a mostra el protocol de reproducció utilitzat per generar PT-VDAC1-KO. Es va utilitzar RT-PCR per genotipar els ratolins PT-VDAC1-KO; això es va fer mitjançant l'amplificació d'un al·lel floxat d'un fragment d'ADN 416-bp i un fragment d'ADN de 370-pb del gen Cre (figura 7, b; carrils 4 i 6). Els ratolins de tipus salvatge (PT-VDAC1-WT) no tenien el gen Cre (figura 7, b, carrils 2 i 3). L'anàlisi d'immunoblot va indicar que els nivells d'expressió de VDAC1 a les còrtexs renals dels ratolins PTVDAC1-KO eren inferiors als dels ratolins PTVDAC1-WT després d'un tractament isquèmic o simulat (figura 7 c i d). Això es va verificar encara més mitjançant la tinció immunohistoquímica de VDAC1 (figura 7e). Aquestes dades van verificar que havíem establert correctament un model de ratolí PT-VDAC1-KO.

Figura 7. Creació i característiques del model de ratolí PT-VDAC1-KO. ( a, b ) El protocol de reproducció per a la generació de ratolins PTVDAC1-KO i la detecció per PCR del genotip d'al·lels de tipus salvatge i flox de l'al·lel VDAC1 i PEPCK-Cre. (c) L'anàlisi d'immunoblot de VDAC1 i b-tubulina mitjançant teixits corticals renals de ratolins PT-VDAC1-KO i PT-VDAC1-WT després d'una lesió IR. (d) Anàlisi de la imatge en escala de grisos entre ells. ( e ) Tinció immunohistoquímica de VDAC1 als teixits corticals renals de ratolins de tipus salvatge i VDAC1 després de lesions IR. Ampliació original x 400. Barra de cicatrius: 100µM. Cada experiment (c & e) es va repetir 6 vegades de manera independent amb resultats similars. Es va utilitzar ANOVA unidireccional per a les comparacions de grups múltiples (d). # pàg<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Feu clic aquí per conèixer els avantatges de Cistanche

8. La lesió renal induïda per I/R, l'apoptosi de cèl·lules tubulars i el dany mitocondrial es van millorar en ratolins PTVDAC1-KO

Els companys de camada dels ratolins PT-VDAC1-WT i PT-VDAC1-KO es van tractar amb isquèmia (28 min) seguida d'una lesió de reperfusió (48 h). Després vam adquirir mostres de sang i teixits renals per a un examen posterior. Vam trobar que PT-VDAC1-KO va suprimir notablement l'elevació induïda per I/R en els nivells de BUN i creatinina (figura 8 a i b). En segon lloc, les anàlisis histològiques i TUNEL van demostrar més que PT-VDAC1-KO va atenuar notablement el dany tissular induït per I/R i l'apoptosi de les cèl·lules renals (figura 8 c, d, f i g). En tercer lloc, les anàlisis EM van trobar que PT-VDAC1-KO va atenuar significativament el dany mitocondrial induït per I/R (figura 8 e i h). Finalment, la immunoblotting va confirmar que els ratolins PT-VDAC1-KO mostraven nivells reduïts de caspasa escindida-3, una menor acumulació de Bax als mitocondris i menors taxes d'alliberament de Cyt-c al citosol (figura 8 I-o). Aquestes dades van indicar que VDAC1 també va mediar l'AKI induït per I/R.

Figura 8. Atenuació de lesions renals induïdes per IR, apoptosi de cèl·lules tubulars, danys mitocondrials i expressió de Bax, Cyt-c i caspasa clivada en ratolins PT-VDAC1-KO. Les artèries renals bilaterals dels ratolins PT-VDAC1-KO i PT-VDAC1-WT es van fixar durant 28 min i després es van alliberar durant 48 h per establir un model IR. (a) BUN. (b) Creatinina sèrica. (c) Tinció d'hematoxilina i eosina. ( d ) Seccions representatives de cèl·lules positives de TUNEL. ( e ) Detecció de la morfologia del mitocondri al microscopi electrònic. (f) Puntuació de dany tubular. (g) El nombre de cèl·lules positives per a TUNEL. (h) Puntuació de lesions mitocondrials. (i) Els immunoblots analitzen l'expressió de caspasa3, VDAC1 i DsbA-L escindida, així com l'expressió de BAX i Cyt-c en fraccions mitocondrials i citosòliques. La b-tubulina i la GAPDH es van utilitzar com a control de càrrega de lisat o citosòlic sencer, respectivament. COX IV es va utilitzar com a control de càrrega de mitocondris. (j- p) Anàlisi de la imatge en escala de grisos entre elles. Ampliació original x 400. Barra de cicatrius: 100 µM en c i d 20 µM en e. Cada experiment (c-e&i) es va repetir 6 vegades de manera independent amb resultats similars. Es va utilitzar ANOVA unidireccional per a les comparacions de grups múltiples (a, b, f-h&j-p). # pàg<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. La sobreexpressió del dany renal induït per I/R agreujat per DsbA-L es va atenuar en ratolins PT-VDAC1-KO

de DsbA-L durant la lesió isquèmica. Una setmana abans que s'establís el model de ratolí d'IR, vam injectar la vena de la cua de cada ratolí amb el plasmidi DsbA-L (la injecció es va realitzar dues vegades durant aquesta setmana). La sobreexpressió de DsbA-L va agreujar l'elevació induïda per IR de l'expressió de BUN i creatinina, dany renal i apoptosi renal; aquests efectes es van atenuar en els ratolins PTVDAC1-KO (figura 9 a-d, e i f). Els resultats d'immunoblot van indicar a més que la sobreexpressió de DsbA-L va millorar l'augment induït per IR de la caspasa escindida -3, l'acumulació de Bax als mitocondris i l'alliberament de Cyt-c al citosol; aquests efectes es van reduir en els ratolins PT-VDAC1-KO (figura 9 g i h-l). Col·lectivament, aquests resultats van demostrar encara més que VDAC1 va mediar l'efecte de DsbA-L durant la lesió isquèmica.

Figura 9. La sobreexpressió del dany renal induït per I/R agreujat per DsbA-L es va atenuar en ratolins PT-VDAC1-KO. Els ratolins PT-VDAC1-KO i PT-DsbA-L-WT es van tractar amb o sense plasmidi DsbA-L i després es van establir un model IR. (a) BUN. (b) Creatinina sèrica. (c) Tinció d'hematoxilina i eosina. ( d ) Seccions representatives de cèl·lules positives de TUNEL. (e) Puntuació de dany tubular. (f) El nombre de cèl·lules positives per a TUNEL. ( g ) Els immunoblots van analitzar l'expressió de caspasa3, VDAC1 i DsbA-L escindida, així com l'expressió de BAX i Cyt-c en fraccions mitocondrials i citosòliques. La b-tubulina i la GAPDH es van utilitzar com a control de càrrega de lisat o citosòlic sencer, respectivament. COX IV es va utilitzar com a control de càrrega de mitocondris. (h- n) Anàlisi de la imatge en escala de grisos entre ells. Ampliació original x 400. Barra de cicatrius: 100 mM. Cada experiment (c-e) es va repetir 6 vegades de manera independent amb resultats similars. Es va utilitzar ANOVA unidireccional per a les comparacions de grups múltiples (a, b i f-n). # pàg<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Suplement de Cistanche

10. L'atenuació del dany renal induït per I/R en ratolins PTDsbA-L-KO es va reduir per la sobreexpressió de VDAC1

Per confirmar encara més si el dany tubular mediat per DsbA-L depenia de VDAC1, els ratolins de camada dels ratolins PTDsbA-L -WT i PT-DsbA-L -KO es van exposar primer al tractament I/R i després es van injectar a través de la vena de la cua. amb el plasmidi de sobreexpressió VDAC1. L'augment dels nivells de BUN i creatinina induït per I/R es va millorar en els ratolins PT-DsbA-L-KO; tanmateix, aquest efecte es va evitar per la sobreexpressió de VDAC1 (figura 10 a i b). La tinció d'HE i TUNEL va demostrar que les extensions relatives del dany del teixit renal induït per IR i l'apoptosi de les cèl·lules renals es van reduir en els ratolins PT-DsbAL -KO i que aquests efectes es van bloquejar per la sobreexpressió de VDAC1 (Figura 10 c-f). L'immunoblotting va demostrar que els ratolins PT-DsbA-L -KO tenien nivells més baixos de caspasa escindida-3, nivells més baixos d'acumulació de Bax als mitocondris i taxes més baixes d'alliberament de Cyt-c al citosol; tanmateix, aquests efectes es van eliminar per la sobreexpressió de VDAC1 (figura 10 g-m). Aquestes dades van donar suport al fet que DsbA-L va promoure la lesió isquèmica d'una manera que depenia de VDAC1.

Figura 10. PT-DsbA-L-KO millora la lesió renal dels ratolins induïts per IR es va reduir per la sobreexpressió de VDAC1. Els ratolins PT-DsbA-L-KO i PT-DsbA-L-WT es van tractar amb o sense plasmidi VDAC1 i després es van establir un model IR. (a) BUN. (b) Creatinina sèrica. (c) Tinció d'hematoxilina i eosina. ( d ) Seccions representatives de cèl·lules positives de TUNEL. (e) Puntuació de dany tubular. (f) El nombre de cèl·lules positives per a TUNEL. ( g ) Els immunoblots van analitzar l'expressió de caspasa3, VDAC1 i DsbA-L escindida, així com l'expressió de BAX i Cyt-c en fraccions mitocondrials i citosòliques. La b-tubulina i la GAPDH es van utilitzar com a control de càrrega de lisat o citosòlic sencer, respectivament. COX IV es va utilitzar com a control de càrrega de mitocondris. (hm) Anàlisi de la imatge en escala de grisos entre elles. Ampliació original x 400. Barra de cicatrius: 100 mM. Cada experiment (c, d i g) es va repetir 6 vegades de manera independent amb resultats similars. Es va utilitzar ANOVA unidireccional per a les comparacions de grups múltiples (a, b, e, f i h-m). # pàg<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. La lesió renal induïda per CLP es va atenuar en ratolins PT-DsbA-LKO o PT-VDAC1-KO

L'IRA induïda per la sèpsia és una altra causa comuna d'IRA a la pràctica clínica. Els companys del PT-DsbA-L o VDAC-WT i PT-DsbA-L o VDAC1-KO van ser sotmesos al model CLP i després eutanasiats 18 h després de la cirurgia. Els resultats van indicar que els ratolins PT-DsbA-L o VDAC1- KO van reduir notablement les elevacions induïdes per CLP dels nivells de BUN i creatinina, i l'augment dels nivells de dany del teixit renal i apoptosi de les cèl·lules renals (figures S1 i S2 a-f). ). L'immunoblotting va confirmar que els ratolins PTDsbA-L o VDAC1-KO també van mostrar nivells reduïts de caspasa escindida-3, nivells més baixos d'acumulació de Bax als mitocondris i taxes més baixes d'alliberament de Cyt-c al citosol (figures). S1 i S2 g- n). Col·lectivament, aquestes dades van demostrar que tant DsbA-L com VDAC1 van mediar la progressió de l'AKI sèptica.

12. La lesió renal induïda per VAN es va atenuar en ratolins PT-DsbAL-KO o PT-VDAC1-KO

L'AKI induïda per vancomicina (VAN) també és un model important per a l'AKI. Els companys de camada de PT-DsbA-L o VDAC1-WT i PT-DsbA-L o VDAC1-KO es van injectar intraperitonealment amb VAN (600 mg/kg) durant 7 dies consecutius. Els resultats van indicar que els ratolins PT-DsbA-L o VDAC1-KO van reduir notablement l'elevació dels nivells de BUN i creatinina induïda per VAN, el dany del teixit renal i l'apoptosi de les cèl·lules renals (figures S3 i S4 an-f). Les anàlisis d'immunoblot van confirmar a més que els ratolins PTDsbA-L o VDAC1-KO també van mostrar nivells reduïts de caspasa escindida-3, un grau més baix d'acumulació de Bax als mitocondris i taxes més baixes d'alliberament de Cyt-c al citosol (figures S3 i S4 g- m). En resum, aquestes dades van demostrar que tant DsbA-L com VDAC1 van mediar l'AKI induïda per VAN.

Extracte de Cistanche

13. L'apoptosi de cèl·lules HK-2 induïda per I/R mediada per DsbA-L es va associar amb VDAC1

El resultat anterior va trobar que DsbA-L estava implicat en l'apoptosi de les cèl·lules BUMPT, però, la funció de DsbA a les cèl·lules tubulars renals humanes encara no està clara. El siRNA DsbA-L es va transfectar a cèl·lules HK2 i després es va exposar a l'esgotament d'ATP durant 2 hores i a la recuperació durant 2 hores. Els resultats d'immunoblot van demostrar que el siRNA de DsbA-L va millorar notablement l'augment induït per I/R en l'expressió de caspasa escindida -3 i VDAC1, l'augment de l'acumulació de Bax als mitocondris i l'augment de la producció de Cyt-c al citosol ( Figura S5 an- h). Les dades també van suggerir que el paper de DsbA-L en l'apoptosi de les cèl·lules HK2 estava relacionat amb el VDAC1 durant el tractament I/R.

14. L'apoptosi de cèl·lules HK-2 induïdes per I/R mediada per DsbA-L depèn del VDAC1

Per verificar encara més si el paper de DsbA-L en l'apoptosi de les cèl·lules HK2 depèn de VDAC1. Primer, les cèl·lules HK2 es van co-transfectar amb DsbA-L siRNA més amb o sense plasmidi VDAC1 i després es van exposar a l'esgotament d'ATP durant 2 hores i recuperació durant 2 hores. Els resultats d'immunoblot van indicar que el siRNA de DsbA-L va atenuar notablement l'augment induït per I/R en l'expressió de caspasa escindida-3 i VDAC1, l'augment de l'acumulació de Bax als mitocondris i l'augment de la producció de Cyt-c al citosol, aquest efecte es va revertir per la sobreexpressió del plasmidi VDAC1 (figura S6a-h). En segon lloc, les cèl·lules HK2 es van co-transfectar amb el siRNA VDAC1 més amb o sense plasmidi DsbA-L i després es van exposar a I (2 h) / R (2 h). Els resultats d'immunoblot van mostrar que el siRNA de VDAC1 va millorar notablement l'augment induït per I/R en l'expressió de caspasa escindida-3 i VDAC1, l'augment de l'acumulació de Bax als mitocondris i l'augment de la producció de Cyt-c al citosol, aquest efecte no es va millorar per la sobreexpressió del plasmidi DsbA-L (figura S7a-h). Les dades van verificar clarament que VDAC1 va mediar el paper pro-apoptosi de DsbA-L a les cèl·lules HK-2 durant el tractament I/R.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h i Dongshan Zhang a,b *

un Departament de Medicina d'Emergències, República Popular de la Xina

b Institut de Medicina d'Emergència i Malalties Difícils, Segon Hospital Xiangya, Universitat Central Sud, Changsha, Hunan 410011, República Popular de la Xina

c Departament d'Oftalmologia, República Popular de la Xina

d Departament de Cirurgia Urinària, República Popular de la Xina

e Departament de Cirurgia toràcica, República Popular de la Xina

f Departament de Cirurgia General, Segon Hospital Xiangya, República Popular de la Xina

g Departament de Salut Pública, Universitat Central Sud, Changsha, Hunan, República Popular de la Xina

h Departament d'endocrinologia, Hospital Popular de Shenzhen, Segon Col·legi de Medicina Clínica de la Universitat de Jinan, Primer Hospital Afiliat de la Universitat de Ciència i Tecnologia del Sud, Shenzhen, República Popular de la Xina

1 Xiaozhou Li i Jian Pan van contribuir per igual a aquest estudi