La proteòmica quantitativa revela diferències significatives entre les formacions del cervell del ratolí

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:L'envelliment s'associa a una disminució general de les funcions cognitives, que sembla ser deguda a alteracions en les quantitats de proteïnes implicades en la regulació de la plasticitat sinàptica. Aquí, presentem una anàlisi quantitativa de proteïnes implicades en la neurotransmissió en tres regions cerebrals, és a dir, l'hipocamp, l'escorça cerebral i el cerebel, en ratolins d'1 i 22 mesos, mitjançant la tècnica d'enfocament de proteïnes totals. Constatem que, tot i que el títol d'algunes proteïnes implicades en la neurotransmissió i la plasticitat sinàptica es veu afectat per l'envelliment de manera similar en totes les formacions cerebrals estudiades, de fet, cadascuna de les formacions representa el seu propi mode d'envelliment. En general, els proteomes de l'hipocamp i corticals són molt més inestables durant la vida que el proteoma cerebel·lar. Les dades que es presenten aquí proporcionen una imatge general de l'efecte de l'envelliment fisiològic sobre la plasticitat sinàptica i podrien suggerir dianes farmacològiques potencials per a teràpies anti-envelliment.

Feu clic aquí per saber-ne més

Paraules clau:transmissió glutamatèrgica i GABAèrgica; Camk2; OXPHOS; matriu extracel·lular; enfocament de proteïnes totals; hipocamp; còrtex; cerebel

1. Introducció

L'envelliment fisiològic està relacionat amb una disminució gradual de les funcions cognitives, com la formació i retenció de la memòria, la velocitat de processament i el raonament conceptual [1]. Està àmpliament acceptat que els canvis associats a l'envelliment són causats principalment per la pèrdua de cèl·lules neuronals; tanmateix, nombrosos estudis han suggerit que l'estructura de la xarxa neuronal, més que el nombre de neurones, es veu afectada durant l'envelliment [2-4]. S'ha demostrat que l'envelliment s'associa amb l'escurçament de les dendrites i una disminució del seu nombre, pèrdua d'espines dendrítiques, una disminució del nombre d'axons dins d'una xarxa i el nivell de la seva mielinització i pèrdua de sinapsis [5]. A més, s'ha demostrat que els mecanismes moleculars subjacents als fenòmens de plasticitat cerebral com la potenciació i depressió a llarg termini de les sinapsis glutamatèrgiques (LTP i LTD) i GABAèrgiques (iLTP i iLTD) i l'eficàcia de diversos sistemes neuromoduladors disminueixen amb l'edat. 6,7]. Diversos estudis han demostrat que els canvis cognitius relacionats amb l'envelliment van acompanyats de canvis en l'expressió i/o localització de proteïnes implicades en la transmissió sinàptica i la plasticitat [6,8]. L'expressió de proteïnes a diverses regions del cervell dels rosegadors s'ha estudiat intensament mitjançant tècniques proteòmiques basades en espectrometria de masses[9,10] i microarrays[11,12].colesterol de cistancheTanmateix, excepte l'estudi de Walter i Mann [10] i l'estudi de Duda et al. [8], totes les investigacions van emprar enfocaments semicuantitatius que no proporcionen informació sobre la concentració precisa de proteïnes a les mostres estudiades.

Recentment, hem mesurat les concentracions de proteïnes implicades en la plasticitat neuronal a l'hipocamp, l'escorça cerebral i el cerebel en ratolins joves (1-mes) i adults (12-mes--) [8]. ]. Vam trobar que, tot i que la quantitat total de proteïnes no va canviar durant la vida, els títols de proteïnes relacionats amb la neurotransmissió i la neuroplasticitat difereixen significativament entre els animals joves i adults, cosa que indica que els símptomes de la transmissió del senyal i el debilitament de la neuroplasticitat es poden observar al mig. -ratolins envellits a nivell proteòmic [8].

cistanche pot anti-envelliment

En aquest article, oferim els resultats d'una anàlisi quantitativa en profunditat dels proteomes hipocampals, corticals i cerebel·losos relacionats amb la plasticitat neuronal de joves (1-mes) i grans (22-mes d'edat). ) ratolins, centrant-se principalment en els canvis relacionats amb l'envelliment en la concentració de proteïnes implicades en la senyalització de glutamat, GABA, acetilcolina i monoamines. També parlem dels canvis en la concentració de proteïnes implicades en l'alliberament de neurotransmissors i la formació de connexions sinàptiques, com ara proteïnes d'adhesió de cèl·lules transsinàptiques i xarxes perineuronals.

Mitjançant el mètode d'enfocament de proteïnes totals sense etiqueta (TPA), vam mesurar els títols de més de 7000 proteïnes a cadascuna de les regions cerebrals estudiades [13]. En aquest article, presentem, fins ara, la descripció proteòmica quantitativa més detallada dels canvis relacionats amb la plasticitat sinàptica durant l'envelliment fisiològic dels ratolins. Segons el que sabem, aquesta és, fins ara, la descripció proteòmica quantitativa més detallada dels canvis relacionats amb la plasticitat sinàptica durant l'envelliment fisiològic dels ratolins.

2. Materials i Mètodes

2.1. Animals i Preparació de Teixits

Els cervells es van aïllar de cinc ratolins femelles C57BL/10J a P30 (joves) i cinc ratolins (d'edat) de 22-mesos. Els animals van ser tractats tal com es descriu a [8]. Breument, els animals van ser anesificats amb isoflurà i decapitats, i els cervells van ser explantats en un tampó fred amb gel (87mMNaCl, 2.5mMKCl, 1.25mMNaHNPO4,25mMNaHCO3,0.5mMCaClz,7mMMgSO, 7mMMgSO, sucrosa, 7mMMgSO, sucrosa, 2.5mMKCl) . Per a la proteòmica quantitativa es van utilitzar totes les regions del cervell: hipocamp dret, còrtex frontal de l'hemisferi dret i hemisferi dret del cerebel, de cada animal.efectes secundaris de cistanche deserticolaTots els procediments van ser aprovats pel comitè d'ètica local (Comitè d'ètica de Wroclaw, permís núm.10/2018) i es va fer tot el possible per minimitzar el nombre d'animals utilitzats per als experiments.

2.2.Preparació de lisats de teixits

Els lisats es van obtenir tal com es descriu a [13]. Les estructures aïllades es van homogeneïtzar en tampó de lisi (0.1 M Tris/HCl, 2% SDS, 50 mM DTT, pH 8.0) i es van incubar durant 5 minuts a 99 graus. Les mostres es van emmagatzemar. a{10}} grau fins a l'anàlisi proteòmica. Es va utilitzar la fluorescència de triptòfan per determinar la concentració total de proteïnes a les mostres [14].

2.3. Preparació de mostres amb filtre de digestió multienzim (MED FASP)

Els lisats que contenien 80 ug de proteïna total es van utilitzar per al MED FASP[15] sense alquilació de la cisteïna [16]. Les proteïnes es van escindir durant la nit amb LysC i després es van digerir amb tripsina durant 3 h. La relació enzim-proteïna era 1:40. Les digestions es van dur a terme a 37 graus en Tris-HCl 50 mM amb l'addició de DTI 1 mM, pH 8,5 [13]Les alíquotes que contenien 8 ug de pèptid total es van concentrar i es van emmagatzemar a -20 graus fins a l'anàlisi d'espectrometria de masses.

2.4.Cromatografia líquida-Espectrometria de masses en tàndem

L'anàlisi de les mescles de pèptids es va realitzar tal com es va descriure anteriorment[13] mitjançant l'espectròmetre de masses QExactive HF (ThermoFisher Scientific, Palo Alto, CA, EUA). Les dades es van dipositar al ProteomeXchange Consortium mitjançant el dipòsit de socis PRIDE [17]. L'identificador del conjunt de dades: PXD025978(nom d'usuari: revisor_pxd025978@ebi.ac.uk;contrasenya: QL3YI7nP).

2.5.Anàlisi de dades proteòmiques

Es va utilitzar MaxQuant v1.2.6.20[18] per a l'anàlisi de dades de MS. Es va utilitzar la base de dades UniProtKB/Swiss-Prot per identificar les proteïnes mitjançant dades de pèptids MS i MS/MS.

La carbamidometilació de la cisteïna es va establir com una modificació fixa.dosificació de cistanche redditLa desviació de massa permesa inicial de l'ió precursor va ser de fins a 6 ppm, i per a les masses de fragments, va ser de fins a 20 ppm. La taxa màxima de descobriment de pèptids falsos es va especificar com a 0,01. El mètode d'enfocament de proteïnes totals [19, 20] es va utilitzar per calcular la concentració molar de proteïnes mitjançant la relació on la quantitat de proteïnes individuals (c(i) es va calcular com la relació de la seva intensitat (MSsignal (i)) a la suma de totes les intensitats (senyal MS total) a la mostra mesurada, multiplicades pel pes molecular (MW(i)) de proteïnes individuals.

2.6.Anàlisi estadística

Les dades es presenten com a mitjana ± SD. La igualtat de variàncies es va calcular mitjançant la prova F de Fisher. Per determinar les diferències entre dos grups experimentals qualsevol, es va utilitzar la prova t de Student. L'anàlisi es va realitzar mitjançant el programari SigmaPlot 11 (Systat Software).

3. Resultats

Les dades proteòmiques completes es van dipositar al ProteomeXchange Consortium i estan disponibles amb l'identificador del conjunt de dades: PXD0255978 (nom d'usuari: revisor_pxd025978@ebi.ac.uk;contrasenya: QL3YI7nP). L'anàlisi dels espectres va permetre la quantificació de 7547 proteïnes a través de les mostres analitzades.Beneficis de l'extracte de cistancheEn l'anàlisi es van utilitzar proteïnes que es van identificar amb almenys un pep-tide únic. En detall, es van determinar quantitativament les dades d'expressió de les proteïnes 7324, 7088 i 7343 a, respectivament, l'hipocamp, l'escorça i el cerebel d'animals vells i es van dipositar al ProteomeXchange Consortium mitjançant el dipòsit de socis PRIDE. Per als animals joves, s'hi van dipositar les dades de les proteïnes 7347, 7323 i 7526 a l'hipocamp, l'escorça i el cerebel, respectivament.

4. Transmissió glutamatèrgica

El glutamat, el principal neurotransmissor excitador del cervell, actua mitjançant receptors ionotròpics i metabotròpics (mGluRs, Grm). Els receptors ionotròpics es divideixen en una de les quatre classes: o-amino-3-hidroxi-5-metil-4-receptors d'àcid propiònic isoxazol (receptors AMPA, Gria), receptors de N-metil-D-aspartat ( Receptors NMDA, Grin), receptors de kainat (Grik) i receptors delta (Grid). 4.1.Gria

El nostre estudi revela que els receptors de glutamat més abundants a l'hipocamp són Gria. Són proteïnes heterotetramèriques [21], i vam trobar que la subunitat Gria2 s'expressava amb el títol més alt tant en hipocamps murins joves com envellits (figura 1A). L'envelliment no va tenir cap efecte sobre l'expressió dels receptors de Gria a l'hipocamp, excepte Gria4, el nivell del qual es va reduir significativament en animals vells. Tanmateix, el títol de Gria4 va ser molt baix en general, en comparació amb altres membres de la família Garcia.

A l'escorça cerebral, Gria eren els receptors ionotròpics de glutamat més omnipresents només en els animals antics (Figura 1B, D). Estadísticament, els canvis en els títols de les subunitats de Gria individuals durant l'envelliment a l'escorça no van ser significatius, però la concentració total de proteïnes Gria va augmentar significativament en animals vells (figura 1B).cistanche genghis khanSimilar a l'hipocamp, Gria2 era la principal isoforma de l'escorça.

Al cerebel, els receptors de glutamat més abundants van ser Grial i Gria2, que es van expressar a nivells molt similars, i l'envelliment no va afectar la seva concentració (figura 1C). 4.2.Somriure

Els receptors NMDA són canals heterotetramèrics dependents del glutamat per als ions de calci i sodi que són crucials per a la plasticitat sinàptica [2] i estan formats per isoformes Grin [23]. Vam trobar que la forma principal de Grin expressada a totes les estructures cerebrals estudiades era Grin1 (figura 1A-C). La concentració d'aquesta isoforma no es va veure afectada per l'envelliment a l'hipocamp i el cerebel; tanmateix, es va reduir significativament a l'escorça (figura 1B). En general, la concentració total de totes les subunitats NMDA, tret de Grin3a (el nivell de la qual no es va veure afectat per l'envelliment i s'expressava a un nivell molt baix en comparació amb altres proteïnes Grin), es va reduir a l'escorça envellida, mentre que no es va modificar al cerebel. Figura 1B, C). A l'hipocamp, l'envelliment es va reflectir per una disminució estadísticament significativa de la quantitat total de proteïnes Grin, i també de les isoformes Grin2b i Grin3a.

4.3.Graella

Gridl i Grid2 són receptors ionotròpics expressats gairebé exclusivament al cerebel, i estan implicats en la regulació de la plasticitat sinàptica [24]. Vam trobar que al cerebel, la isoforma principal és Grid2, i que el seu títol no es veu afectat per l'envelliment (Figura 1C). A l'hipocamp i al còrtex, la concentració de, respectivament, Gridl i Grid2 és significativament menor en animals envellits; tanmateix, el títol d'aquests receptors és molt baix en general (figura 1A, B).

4.4.Grik

Els receptors de kainat són canals de sodi heteromèrics que medien la transmissió ionotròpica i metabotròpica [25,26]. La nostra anàlisi va revelar que la concentració de gairebé tots els membres de la família de proteïnes Grik es va reduir en els antics hipocamps i còrtexs (Figura 1A, B). En canvi, el títol de proteïnes Grik, excepte la isoforma Grik2, no es va veure afectat per l'envelliment en el cerebel (figura 1C).

4.5.Grm

Hem identificat set membres de receptors metabotròpics dependents del glutamat, Grm, en totes les formacions cerebrals estudiades: Grml-7 (Figura 1A-C). La concentració total de proteïnes Grm a l'hipocamp i a l'escorça es va reduir en animals vells ( Figura 1A, B), mentre que el títol total de Grms cerebel·losos no es va canviar significativament per l'envelliment (figura 1C).

L'anàlisi detallada va revelar que els nivells de les isoformes més abundants de Grm (Grm2, Grm3 i Grm5) a l'hipocamp es van reduir significativament en ratolins vells (figura 1A), mentre que a l'escorça, els canvis en els títols de les isoformes més abundants no es van alterar significativament (figura 1B).

5.Transmissió GABAèrgica

L'àcid y-aminobutíric és el neurotransmissor inhibidor més abundant al cervell i pot interactuar amb dos tipus de receptors: el receptor ionotròpic GABAA, que és un canal de clorur, i el receptor metabotròpic GABAg. Els receptors GABA són proteïnes pentamèriques formades per diverses subunitats ∶ a (Gabra), （Gabrb）, y (Gabrg) i δ（Gabrd）【27】GABAg és un receptor heterodimèric acoblat a proteïnes G format per Gabbrl i Gabbrts[282] . 6.GABAA-Gabr

La nostra anàlisi va demostrar que la concentració total de la proteïna GABA es va reduir significativament a l'hipocamp i l'escorça dels ratolins vells, però no es va veure afectada per l'envelliment del cerebel (figura 2A). Aquests canvis es van reflectir per alteracions en l'expressió de subunitats individuals del receptor GABAA (figura 2B-D). 6.1.Gabra(subunitat a)

Vam trobar que la concentració global de subunitats de Gabra no es va veure afectada per l'envelliment en totes les formacions cerebrals estudiades (figura 2B-D). La isoforma més abundant va ser Gabral. Dins de les subunitats a, només l'expressió de Gabra3 i Gabra5 va ser influenciada per l'envelliment (figura 2B-D). L'únic canvi estadísticament significatiu es va associar amb Gabra4, el títol del qual es va reduir a l'escorça dels animals envellits (figura 2C). 6.2.Gabrb(subunitat)

La nostra anàlisi va demostrar que la subunitat era la subunitat GABAA més omnipresent en totes les estructures cerebrals estudiades, tant en animals joves com en vells (Figura 2B-D), i la principal isoforma de la subunitat era Gabrb2 (Figura 2B-D). Gabr2b era el més alt al cerebel, mentre que a l'hipocamp i l'escorça, els seus títols eren similars (figura 2B-D). No vam observar cap canvi significatiu associat a l'envelliment en l'expressió de les isoformes de la subunitat a l'hipocamp i el cerebel. Tanmateix, a l'escorça, el títol total de Gabrb es va reduir significativament, i això es va relacionar amb una disminució del títol de Gabrb2 (figura 2C).

6.3.Gabrg (subunitat)

Entre les subunitats y del receptor GABAA, Gabrg2 es va expressar al nivell més alt a l'escorça i el cerebel (figura 2C, D), i era l'única subunitat y que vam poder detectar a l'hipocamp (figura 2B). A l'hipocamp i còrtex, la concentració total d'isoformes de Gabrg va ser gairebé dues vegades més gran en animals joves que en vells (figura 2A, B). D'altra banda, la concentració total de subunitats i no es va veure afectada per l'envelliment al cerebel (figura 2D). 6.4.Gabrd（subunitatδ）

En ratolins vells, la subunitat $ es va expressar principalment al cerebel (figura 2B-D). El títol de Gabrd al cerebel dels ratolins envellits era unes deu vegades més gran que a l'escorça i més de 25 vegades més que a l'hipocamp (figura 2B-D). L'envelliment no va tenir cap efecte sobre l'expressió de Gabrd a l'hipocamp i el cerebel, però a l'escorça, el títol del receptor es va reduir més de tres vegades per l'envelliment (figura 2C). 7.GABAb-Gabbr

Gabbr és un receptor metabotròpic heterodimèric format per les subunitats Gabbrl i Gabbr1, i la seva funció s'acobla a l'activació d'una proteïna G i la modulació de les activitats dels efectors aigües avall com l'adenilat ciclasa [29]. Vam trobar que l'expressió de les dues subunitats del receptor metabotròpic es va reduir a l'hipocamp dels animals envellits (Figura 2B). Al cerebel, la quantitat de Gabbr no es va veure afectada per l'envelliment. També vam poder observar una reducció significativa de la suma de les concentracions de la subunitat Gabbr a l'escorça, tot i que per separat, els canvis en els títols de les subunitats no van ser estadísticament significatius (figura 2C). 8.Gad

Gad és un enzim que descarboxila el glutamat per produir GABA [30]. Les nostres dades mostren que l'expressió de la isoforma principal de Gad a l'hipocamp, Gad2, no es va veure afectada per l'envelliment; tanmateix, el nivell d'una altra isoforma de Gad, Gad1, es va elevar significativament (figura 2B). També vam poder observar augments significatius dels títols de les dues isoformes de Gad al cerebel d'animals vells (figura 2D), però no hi va haver canvis en l'expressió de Gad a l'escorça dels ratolins vells (figura 2C).

9. Quineses dependents de calci/calmodulina

L'activació de la proteïna quinasa dependent de calci/calmodulina (Camk) és la primera etapa de transformació de la senyalització del calci en diverses formes de plasticitat sinàptica (per a una revisió, vegeu [31,32]). 9.1.Camk1

L'única isoforma de Camkl que hem trobat a la nostra anàlisi va ser Camkld. També vam observar alguns pèptids associats a Camkl, però no vam poder anotar-los amb precisió a les isoformes de Camkl seleccionades (es descriuen com a "Camkl", figura 3A-C). En la nostra anàlisi, no vam observar cap envelliment significatiu associat. canvis en la concentració d'aquest grup de Camk a l'hipocamp i a l'escorça (Figura 3A, B). D'altra banda, el títol de Camkl va augmentar significativament al cerebel dels ratolins vells (Figura 3C).

9.2.Camk2

Camk2 pertany a les proteïnes més omnipresents de totes les estructures cerebrals [8,3]. Vam trobar que entre les isoformes de Camk2, el títol de Camk2a és el més alt de totes les estructures cerebrals estudiades (Figura 3A-D), i que la seva concentració a l'hipocamp i l'escorça és moltes vegades superior al títol de Camk2b, el segon més abundant. isoforma de Camk2 (figura 3A, B). L'envelliment no va tenir cap efecte sobre les concentracions de les isoformes Camk2, excepte Camk2d, el nivell del qual es va reduir a l'hipocamp dels ratolins vells (figura 3A).

9.3.Camk4

El paper molecular de Camk4 en la plasticitat sinàptica és diferent de Camk2. El Camk4 actiu es localitza al nucli cel·lular i regula la transcripció dels gens implicats en la fase tardana de la formació de la memòria [32].

El nostre estudi revela que la concentració de Camk4 es va reduir significativament, gairebé dues vegades, en totes les formacions cerebrals analitzades d'animals vells (figura 3A-D). El títol de proteïnes va ser el més baix a l'hipocamp i el més alt al cerebel (figura 3A-D).

9.4.Camkk

Les proteïnes cinases depenents de calci/calmodulina (Camkk) fosforilen i regulen l'activitat de les proteïnes Camk. La nostra anàlisi va revelar que la concentració total de Camkk no es va veure afectada de manera estadísticament significativa per l'envelliment a l'hipocamp i l'escorça (figura 3A, B, D). Al cerebel, el nivell de la isoforma Camkkl va augmentar més de 3- vegades. en animals vells, mentre que la concentració de Camkk2 era més de dues vegades menor en animals vells (figura 3C).

10. Proteïna quinasa dependent de Prka-cAMP (PKA)

Prka és una serina proteïna quinasa conservada amb una àmplia distribució i una especificitat relativament baixa, que pot fosforilar diverses subunitats dels receptors AMPA i NMDA i modular la seva funció [34]. 10.1.PKA Subunitats catalítiques—Prkac

La nostra anàlisi va demostrar que a l'hipocamp, les subunitats catalítiques més abundants de PKA són Prkaca i Prkacb (figura 4). Les concentracions de subunitats individuals no es van veure afectades per l'envelliment; tanmateix, la concentració total de proteïna Prkac va disminuir lleugerament però estadísticament significativa en ratolins envellits (figura 4A, D). De manera semblant a l'hipocamp, a l'escorça i el cerebel, les subunitats catalíticas més omnipresents de la PKA eren Prkaca i Prkacb; tanmateix, les concentracions de les proteïnes no difereixen entre animals joves i vells (Figura 4B, C). 10.2.Subunitats reguladores PKA——Prkar

Vam trobar que l'expressió global de les isoformes de Pekar era la més alta a l'escorça, mentre que a l'hipocamp i el cerebel, el nivell de Prkar era similar (figura 4A-D). L'envelliment no va tenir cap efecte sobre la concentració total de Prkar, i l'única diferència relacionada amb l'edat va ser un nivell reduït de Prkar2b a l'hipocamp dels ratolins vells (figura 4A).

11. Proteïnes quinases activades per mitogens—Mapk

Les proteïnes Mark regulen un ampli espectre de processos citoplasmàtics i nuclears implicats en la plasticitat neuronal [35].

Els resultats que es presenten aquí demostren que Maple era el Mapk més abundant a l'hipocamp (figura 4A). La concentració total de Mapk a l'hipocamp no es va veure afectada per l'envelliment (figura 4A, D); tanmateix, l'expressió de Mapk3 era al voltant d'un 23 per cent més gran en vells. animals (figura 4A) i Mapk15 es va augmentar gairebé set vegades en hipocamps envellits (figura 4A).

Tant a l'escorça com al cerebel, la concentració total de Mapk no es va veure afectada per l'envelliment, i Mapk1 va ser la cinasa principal expressada a les dues estructures cerebrals (figura 4B, C).

Aquest article està extret de Cells 2021, 10, 2021. https://doi.org/10.3390/cells10082021 https://www.mdpi.com/journal/cells