L'AKT activat per precondicionament controla la tolerància neuronal a la isquèmia mitjançant la via MDM2-p53Ⅰ

Resum

Un dels mecanismes més importants de la neuroprotecció mediada pel precondicionament és l'atenuació de l'apoptosi cel·lular, induint la tolerància cerebral després d'una isquèmia lesiva posterior. En aquest context, la via de senyalització antiapoptòtica PI3K/AKT té un paper clau en la regulació de la diferenciació i la supervivència cel·lular.

Feu clic a cistanche tubulosa en pols perneuroprotecció

Se sap que l'AKT actiu augmenta l'expressió del doble minut-2 murí (MDM2), una E3-ubiquitina lligasa que desestabilitza p53 per promoure la supervivència de les cèl·lules canceroses. A les neurones, recentment hem demostrat que la interacció MDM2-p53 es potencia pel precondicionament farmacològic, basat en l'estimulació subtòxica del receptor de glutamat NMDA, que prevé l'apoptosi neuronal induïda per la isquèmia.

Tanmateix, es desconeix si aquest mecanisme contribueix a la tolerància neuronal durant el precondicionament isquèmic (IPC). Aquí, mostrem que l'IPC va induir la fosforilació d'AKT mediada per PI3K a Ser473, que al seu torn va fosforilar MDM2 a Ser166. Aquesta fosforilació va desencadenar l'estabilització nuclear de MDM2, donant lloc a la desestabilització de p53, evitant així l'apoptosi neuronal en un insult isquèmic. La inhibició de la via PI3K/AKT amb wortmannina o per silenciament AKT va induir l'acumulació de MDM2 citosòlic, abrogant la neuroprotecció induïda per IPC.

Així, l'IPC millora l'activació de la via de senyalització PI3K/AKT i promou la tolerància neuronal controlant la interacció MDM2-p53. Les nostres troballes proporcionen una nova via mecanicista implicada en la neuroprotecció induïda per IPC mitjançant la modulació de la senyalització AKT, cosa que suggereix que l'AKT és un objectiu terapèutic potencial contra la lesió isquèmica. Paraules clau: AKT; MDM2; p53; PI3K; tolerància isquèmica; precondicionament

1. Introducció

En humans, s'ha revelat l'existència d'un atac isquèmic transitori (AIT) com un estat precondicionat endogen amb els beneficis dels resultats funcionals en pacients amb ictus [1–3]. La neuroprotecció endògena induïda per un estímul isquèmic curt i subtòxic, conegut com a precondicionament isquèmic (IPC), es considera una estratègia en el camp emergent de la neuroprotecció contra lesions isquèmiques [4-6].

L'evidència mostra que la neuroprotecció promoguda per IPC depèn dels mecanismes de transcripció, traducció i post-traducció, que altera la funció de les proteïnes clau després de la isquèmia [6-11]. Tanmateix, el mecanisme implicat en la tolerància isquèmica (IT) induïda per IPC no s'ha aclarit completament al cervell humà [12,13].

El desenvolupament de nous enfocaments experimentals per entendre la neuroprotecció mediada per IPC representa una eina poderosa per desxifrar els mecanismes endògens subjacents a la TI cerebral [6], que tenen el potencial de revelar noves dianes terapèutiques destinades a minimitzar el dany cerebral en pacients amb ictus. En les dues últimes dècades, la mort de cèl·lules neuronals apoptòtiques s'ha posicionat com un mecanisme essencial implicat en la lesió isquèmica cerebral [14–16]. En aquest sentit, la proteïna cinasa B o AKT, una serina/treonina quinasa que requereix activar una fosfoinosítid quinasa funcional (PI3K) s'ha considerat un objectiu essencial per a les teràpies neuroprotectores després de la isquèmia [17,18].

Recentment, hem demostrat que la inhibició de la via de senyalització PI3K/AKT augmenta la susceptibilitat neuronal a l'excitotoxicitat [19]. L'AKT està implicat en una complexa xarxa de senyalització anti-apoptòtica [20], els components de la qual poden estar presents en diferents ubicacions subcel·lulars depenent del tipus de teixit [21,22]. Al cor, AKT ha estat implicat en la cardioprotecció promoguda pel precondicionament [23].

L'evidència també mostra que l'AKT fosforilada afavoreix la supervivència neuronal a l'inici de la isquèmia cerebral [24]. Tot i que l'activació de l'AKT pot contribuir a la inducció de TI al cervell [25], el mecanisme exacte que implica la seva activació mediada per IPC segueix sent difícil de resoldre. A les cèl·lules tumorals, l'activació de la via de senyalització PI3K/AKT condueix a la fosforilació de MDM2 a Ser166/186, que promou la translocació nuclear de MDM2 [26, 27] i millora la seva activitat d'ubiqüitinació [28].

Al nucli, MDM2 s'uneix a p53 i afavoreix la seva ubiquitinació i la posterior degradació proteasòmica, que inhibeix la funció de p53 [29]. En condicions d'estrès, p53 també podria desencadenar la sobreexpressió de MDM2, que suprimeix l'activació de p53 en un bucle de retroalimentació negativa [30]. La inhibició de PI3K impedeix l'activació d'AKT [31] i la fosforilació de MDM2 al cor precondicionat [32].

En aquest context, hem trobat anteriorment que el precondicionament cerebral in vivo va reduir el volum de l'infart després de l'oclusió transitòria de l'artèria cerebral mitjana (tMCAO) augmentant l'expressió del nivell de proteïna MDM2. En conseqüència, el complex MDM2-p53 va atenuar l'activació induïda per la isquèmia de la via de senyalització p53/PUMA/caspase -3 a les neurones corticals primàries [33].

Aquí, analitzem el paper de la via de senyalització PI3K/AKT en la tolerància neuronal mediada per IPC contra una lesió isquèmica posterior, així com el mecanisme subjacent, i ens centrem principalment en l'enllaç potencial entre l'activació d'AKT i el complex MDM2-p53. .

2. Resultats

2.1. Neuroprotecció promoguda per IPC

Està mediat per la fosforilació d'AKT a Ser473, la fosforilació de MDM2 a Ser166 i la desestabilització de p53 Anteriorment hem descrit l'impacte de la interacció MDM2-p53 sobre la susceptibilitat neuronal a la isquèmia [34] i IT [33]. Aquí, vam explorar el paper potencial de l'AKT en la neuroprotecció mediada per IPC com a candidat a participar en la via MDM2-p53.

En primer lloc, vam confirmar que la isquèmia va promoure l'activació d'AKT a les neurones, com ho demostra la fosforilació d'AKT a Ser473. Com es mostra a la figura 1A, l'OGD curta (20 min) va induir significativament l'expressió p (Ser473) AKT i MDM2, mentre que els nivells de proteïna AKT es van mantenir inalterats (figura S1A). Tanmateix, no es va observar la fosforilació AKT quan les neurones van ser sotmeses a OGD prolongada (90 min). A més, els nivells de proteïna MDM2 eren més baixos, cosa que és coherent amb la major expressió de la proteïna p53 tal com es mostra a la figura 1A.

La regulació depenent del temps de l'expressió de Mdm2 després de l'OGD (figura 1B) confirma que la isquèmia subaguda pot ser important per induir mecanismes que impedeixin l'estabilització de p53 després de l'OGD, tal com es va descriure anteriorment [33]. Hem utilitzat OGD curt (20 min) seguit de 2 h de reoxigenació com a model d'IPC (Figura S1B) [33]; així, es van analitzar els extractes neuronals recollits a les 4 h de reoxigenació després d'OGD (OGD/R) o després d'OGD precedits pel protocol IPC (IPC més OGD/R). Paral·lelament, les neurones es van incubar en configuracions de normoxia (Nx) o de precondicionament (IPC) (figura S1B).

Tal com es mostra a la figura 1C i la figura S1C, l'IPC va induir l'activació primerenca d'AKT, tal com es va revelar per la fosforilació a Ser473 [35], seguida de l'estabilització de la proteïna MDM2 i la fosforilació a Ser166. L'IPC també va impedir l'estabilització de p53 induïda per OGD / R (figura 1C). Curiosament, les imatges d'immunofluorescència que es mostren a la figura 1D van revelar que l'IPC va promoure la fosforilació d'AKT a Ser473 a les neurones, que s'acumulava predominantment al nucli, i va disminuir l'estabilització de p53 després d'OGD/R (IPC més OGD/R) en comparació amb les neurones no condicionades (OGD). /R).

En conseqüència, l'IPC va prevenir l'apoptosi neuronal i l'activació de la caspasa-3 causada per OGD/R, tal com es va mesurar mitjançant citometria de flux (figura S1D) i assajos de fluorimetria (figura S1E), respectivament. Per confirmar el paper de p53 en la neuroprotecció mediada per IPC, vam utilitzar neurones que expressaven (tipus salvatge; pes) o no (knockout; ko) proteïna p53. Els nostres resultats mostren que les neurones que no tenien p53 (figura S1F) eren més resistents a l'apoptosi induïda per OGD que les neurones p53 wt.

A més, els nivells d'apoptosi a les neurones p53KO eren similars als observats en les neurones de pes precondicionades (IPC més OGD/R) (figura S1G), confirmant així el paper clau de la desestabilització de p53 en la neuroprotecció mediada per IPC [33]. Els nostres resultats mostren que l'IPC va induir la neuroprotecció contra un insult isquèmic mitjançant un mecanisme que implica la fosforilació d'AKT a Ser473, l'estabilització de MDM2 i la fosforilació a Ser166 i la desestabilització de p53.

2.2. L'IPC desencadena la fosforilació MDM2 a Ser166 mitjançant la via PI3K/AKT

La via de senyalització PI3K/AKT està implicada en la TI neuronal tant in vitro [36] com in vivo [37]. No obstant això, el paper de l'activació mediada per IPC de la via PI3K/AKT en la regulació del complex MDM2-p53 continua sense explorar. Per aclarir-ho, les neurones es van incubar amb l'inhibidor irreversible i específic de la via PI3K/AKT, la wortmannina [19].

Com es mostra a la figura 2A, la wortmannina va abrogar la fosforilació AKT millorada amb IPC (Ser473) i la desestabilització de p53, tal com es mostra a la figura 1D. Aquests resultats suggereixen un enllaç directe entre l'activació d'AKT i la inhibició de l'apoptosi neuronal mediada per p53-(figura S1D) i l'activació de la caspasa-3 (figura S1E) induïda després de l'OGD/R. El principal regulador de l'estabilització de p53, MDM2, és un objectiu de l'AKT [26], que fosforila MDM2 a Ser166 i Ser186 [26]. La inhibició de PI3K amb wortmannina va impedir la fosforilació de (Ser473) AKT i (Ser166) MDM2 induïda per IPC (figura 2B).

La fosforilació específica de MDM2 mediada per Akt a Ser166 induïda per IPC es va confirmar mitjançant l'ús d'un petit ARN interferent (siRNA) dissenyat específicament contra la proteïna AKT1 (siAkt), altament expressada en neurones corticals, i l'activitat de la qual és essencial per a la supervivència neuronal després de la isquèmia. 38]. Com es mostra a la figura 3, siAkt va reduir els nivells totals de proteïnes AKT i p (Ser473) AKT el dia 3 després de la transfecció, tant a les cèl·lules T HEK -293 (figura 3A) com a les neurones corticals (figura 3B).

A més, la derrota AKT (siAkt) va impedir la fosforilació (Ser166) MDM2 (figura 3B). Aquests resultats demostren que la via de senyalització PI3K/AKT activada per IPC promou la fosforilació de MDM2 a Ser166, que pot ser responsable de l'estabilització de MDM2 i la consegüent desestabilització de p53 després d'una lesió isquèmica.

2.3. L'AKT activat per IPC desencadena l'estabilització de la proteïna MDM2 nuclear després de la isquèmia

L'activació d'AKT ha estat implicada en la translocació nuclear de MDM2 a les cèl·lules tumorals [26]. Tenint en compte la rellevància de l'estabilització nuclear de MDM2 per a la supervivència neuronal després de la isquèmia [34] i, més concretament, el seu paper neuroprotector en IPC [33], vam decidir investigar més la rellevància de la via de senyalització PI3K/AKT en la regulació de la localització subcel·lular de MDM2. proteïna.

Així, les neurones o les cèl·lules T HEK-293es van transfectar amb proteïna etiquetada amb MDM2-humana (MDM2-GFP). A la figura 4A i a la figura S1H es mostren taques representatives de cèl·lules T HEK-293 transfectades i imatges de neurones que expressen ectòpicament proteïna MDM2 humana després de quatre condicions experimentals diferents (Nx, IPC, OGD/R i IPC més OGD/R). , respectivament.

L'expressió ectòpica de MDM2- GFP va confirmar que l'IPC promou l'acumulació nuclear de MDM2 en comparació amb les neurones isquèmiques no precondicionades (OGD/R) o normoxiques (Nx) (figura 4A, B), tal com es revela per la quantificació de la relació de fluorescència nuclear/citosòlica. (Figura S2B) i intensitat de fluorescència nuclear de MDM 2-GFP (Figura S2C).

2.4. L'IPC promou la interacció p (Ser473) AKT i MDM2, que millora l'estabilització de MDM2 al nucli i redueix l'apoptosi neuronal induïda a la isquèmia

Després de la demostració del paper de l'activació millorada per IPC de la via PI3K / AKT en l'estabilització nuclear de MDM2, vam investigar més si p (Ser473) AKT i MDM2 van interactuar dins del nucli (figura 6A). La immunoprecipitació de MDM2 a partir d'extractes de proteïnes nuclears, seguida de la immunoblotting contra MDM2 i p(Ser473)AKT, va revelar que l'IPC va promoure la interacció entre p(Ser473)AKT i MDM2, després d'OGD/R, evitant així l'estabilització nuclear de p53 induïda per OGD/R, tal com es mostra a l'entrada del nucli (figura 6A).

Finalment, vam estudiar l'efecte perjudicial de la interrupció de la via PI3K / AKT sobre l'apoptosi neuronal (figura 6B). La inhibició d'AKT va contrarestar l'efecte protector de l'IPC abans de l'OGD, cosa que confirma el paper neuroprotector d'AKT-MDM2 en el context de les TI. Els nostres resultats, per tant, demostren que l'IPC indueix la fosforilació i l'activació d'AKT, que promou la fosforilació de MDM2 a Ser166 i la translocació nuclear, on interacciona amb p (Ser473) AKT. Aquest mecanisme pot contribuir a una millor estabilització nuclear de MDM2, que té un paper essencial en la tolerància isquèmica induïda per IPC.

Com protegeix Cistanche les neurones?

Hi ha algunes evidències que suggereixen que Cistanche pot protegir les neurones reduint l'apoptosi (mort cel·lular programada) i promovent la supervivència neuronal. L'apoptosi és un procés natural que es produeix a l'organisme per eliminar les cèl·lules danyades o no desitjades, però pot ser perjudicial quan es produeix de manera excessiva o inadequada. S'ha trobat que Cistanche inhibeix l'apoptosi en estudis de laboratori, i aquest efecte pot ajudar a protegir les neurones dels danys.

A més, Cistanche conté una sèrie de compostos bioactius que s'ha demostrat que tenen efectes neuroprotectors. Per exemple, conté echinacòsid, que s'ha demostrat que protegeix les neurones de l'estrès oxidatiu i la inflamació. També conté acteòsid, que s'ha trobat que té propietats antiinflamatòries i antioxidants.

Continuarà...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 i Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institut de Biologia Funcional i Genòmica, Universitat de Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espanya; eibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Institut d'Investigació Biomèdica de Salamanca, Hospital Universitari de Salamanca, Universitat de Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espanya

3 Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat de Salamanca, 37007 Salamanca, Espanya 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Espanya * Correspondència: mdesteban@usal.es ; Tel.: més 34-923-29-4908