L'AKT activat per precondicionament controla la tolerància neuronal a la isquèmia mitjançant la via MDM2–p53Ⅱ

3. Discussió

Els nostres resultats revelen que l'activació mediada per IPC de la via de senyalització PI3K/AKT activa la TI neuronal controlant el complex MDM2-p53 a les neurones corticals primàries. Primer vam confirmar l'eficiència del precondicionament en termes de neuroprotecció [33,39–41] mitjançant un model experimental IPC validat.

Feu clic als efectes secundaris de cistanche tubulosa per a Neuron

Vam trobar que l'IPC experimental induïda per una privació curta d'oxigen i glucosa (OGD) (20 min) seguida de 2 h de reoxigenació va donar lloc a una neuroprotecció, tal com es mostra amb la prevenció tant de l'apoptosi neuronal com de l'activació de la caspasa-3 induïda per l'activació prolongada. OGD (90 min) seguit de 4 h de reoxigenació (OGD/R). Mostrem que l'IPC redueix l'activació de la caspasa-3 a les neurones corticals, que es correlaciona amb menys apoptosi després d'un insult isquèmic posterior i més greu.

L'equilibri entre els senyals pro i antiapoptòtics és fonamental per garantir la supervivència neuronal després de la isquèmia [3,33,38,42–44]. Tot i que la rellevància d'aquests esdeveniments s'ha demostrat tant en models d'ictus hemorràgic com isquèmic in vivo [43,45], els mecanismes que regulen aquestes vies de senyalització encara no s'entenen completament en el context de la tolerància isquèmica. El paper de l'AKT antiapoptòtic i les seves vies relacionades s'ha estudiat àmpliament en cèl·lules canceroses [46,47] i teixit cerebral [38,48]; tanmateix, fins ara, el paper de la via de senyalització AKT/MDM2-p53 en la tolerància neuronal mediada per IPC contra la lesió isquèmica segueix sent esquiva.

Aquí, vam trobar que l'activació de la via de senyalització PI3K/AKT causada per IPC promou la fosforilació de MDM2 a Ser166, que desencadena la seva translocació nuclear i l'estabilització de proteïnes, evitant l'apoptosi induïda per p53- mitjançant l'activació de la caspasa-3. després de la isquèmia. L'activació de l'AKT mitjançant la fosforilació afavoreix la supervivència neuronal [24,49] i pot contribuir a la inducció de IT [25,50]. Els nostres resultats mostren que l'abundància relativa de proteïna AKT no canvia sota estímuls isquèmics o de precondicionament. Curiosament, vam trobar que la fosforilació precoç d'AKT mediada per PI3K a Ser473 impedeix l'estabilització de p53 induïda per la isquèmia a les neurones precondicionades.

L'efecte no es va deure a modificacions en els nivells d'ARNm p53 [33,34,44] sinó a la disminució dels nivells de proteïna p53 a causa de l'IPC abans de l'OGD/R. Com que MDM2 és el principal regulador de l'estabilització de p53 i també és un objectiu directe de l'AKT, els nostres resultats assenyalen el paper de la via de senyalització AKT/MDM2-p53 en la tolerància neuronal a la isquèmia. L'ARNm de MDM2 augmenta ràpidament després de l'OGD [34], però l'activitat de MDM2 està controlada principalment per modificacions post-traduccionals, especialment la fosforilació [51]. D'acord amb això, vam trobar que, un cop activat per fosforilació després de l'IPC, AKT, al seu torn, fosforila MDM2 al residu Ser166, que es troba a prop del senyal de localització nuclear [52], i aquest efecte es manté després de la lesió OGD/R.

Els nostres resultats mostren que la fosforilació de MDM2 a Ser166 és suficient per exercir l'efecte neuroprotector mediat per IPC mitjançant la desestabilització de p53. Així, aquí, vam identificar una activació depenent del temps de la via AKT / MDM2-p53 després d'una lesió isquèmica i, de fet, demostrem que l'AKT activat per IPC va desencadenar la translocació nuclear de MDM2 ectòpica, així com l'estabilització de proteïnes endògenes.

A més, l'AKT roman actiu dins del nucli, on PI3K també podria migrar en resposta a l'estrès oxidatiu i després explicar la fosforilació d'AKT [53]. La inhibició de la fosforilació d'AKT o AKT mediada per PI3K promou la retenció de la proteïna MDM2 al citoplasma i impedeix la fosforilació Ser166 de MDM2, així com la neuroprotecció mediada per IPC contra l'apoptosi neuronal induïda per la isquèmia. Al contrari, vam demostrar que l'AKT actiu s'uneix a la proteïna nuclear MDM2.

Com a conseqüència, l'AKT actiu promou tant les fosforilacions de MDM2 com la seva estabilització nuclear, que contribueixen a la neuroprotecció mediada per IPC. Els nostres resultats revelen que la neuroprotecció promoguda per IPC depenia de l'activació AKT mediada per PI3K, que va fosforilar MDM2 a Ser166, promovent l'acumulació nuclear de MDM2 després d'un insult isquèmic.

En conseqüència, la inhibició de PI3K / AKT per wortmannina o l'esgotament d'AKT per siRNA va abolir la neuroprotecció promoguda per IPC, donant lloc a l'estabilització de p53 i la posterior apoptosi neuronal després de la isquèmia. Per tant, els nostres resultats ajuden a aclarir el paper essencial de l'activació depenent de l'IPC de la via AKT-MDM2 en la supervivència neuronal contra la lesió isquèmica.

La proteïna p53 està implicada en el control de la mort/supervivència neuronal que determina el pronòstic en pacients amb ictus [34,42,54], així com en pacients amb TIA [3]. L'estabilització de P53 compromet la neuroprotecció mediada pel precondicionament a la lesió per isquèmia/reperfusió [33]. Per tant, la interacció MDM2-p53 serà fonamental per a la supervivència neuronal en aquest context [34] i per a la tolerància mediada per IPC contra lesions isquèmiques [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G al promotor MDM2 determina l'expressió de MDM2 i, al seu torn, modula la recuperació dels pacients que pateixen un ictus [34].

A més, vam observar que un SNP del gen Tp53 (rs1042522) modula l'estabilització mitocondrial de p53 i la tolerància neuronal a la isquèmia alhora que prediu la recuperació funcional dels pacients que pateixen un AIT abans de l'ictus [3]. Per tant, el control de les vies apoptòtiques de p53 serà essencial per garantir l'efecte neuroprotector de l'IPC.

Aquests resultats proporcionen un enfocament translacional de l'estudi que es podria implementar en el futur en benefici dels pacients, i plantegen la via de senyalització PI3K/AKT-MDM2-p53 com un objectiu essencial per a les estratègies de TI promogudes pel precondicionament en l'ictus isquèmic. En resum, demostrem que la via de senyalització PI3K/AKT millorada per IPC promou la fosforilació de MDM2 a Ser166, donant lloc a la translocació nuclear de MDM2 i la seva estabilització, que desencadena la TI neuronal promovent la desestabilització de p53 i la posterior inactivació de la mort apoptòtica induïda després de l'insult isquèmic.

Els nostres resultats posen de manifest els beneficis potencials de l'activació precoç d'AKT en la tolerància neuronal mediada per IPC, que regula la via apoptòtica MDM2-p53 sota lesió isquèmica. Aquestes troballes posen de manifest una oportunitat per entendre els mecanismes que regulen la via de senyalització neuronal AKT-MDM2-p53 per desenvolupar noves estratègies neuroprotectores per als trastorns relacionats amb les TI.

4. Materials i Mètodes

4.1. Cultius primaris de neurones corticals

Els cultius neuronals es van preparar a partir de còrtexs d'embrions de ratolí (14,5E) C57Bl/6J o p53-null (Tp53-/-, B6.129S2, The Jackson Laboratory). Les neurones es van sembrar a 1,8 × 105 cèl·lules/cm2 en un medi neurobasal suplementat amb un 2 per cent de B27 i 2 mM de glutamina (Invitrogen, Madrid, Espanya) i es van incubar a 37 ◦C en una atmosfera humidificada amb un 5 per cent de CO{18}}. 55].

4.2. Models de privació d'oxigen i de precondicionament de glucosa

Després de 9-1{{10}} dies in vitro (DIV), les neurones es van exposar a la privació d'oxigen i glucosa (OGD) incubant cèl·lules a 37 ◦C durant 90 min en una incubadora. equipat amb una tanca d'aire i amb gas contínuament amb un 95 per cent de N2/5 per cent de CO2. El medi d'incubació (solució de Hanks tamponada sense glucosa: 5,26 mM de KCl, 0,43 mM de KH2PO4, 132,4 mM de NaCl, 4,09 mM de NaHCO3, 0,33 mM de Na2HPO4, 2 mM de CaCl2 i 20 mM de gas N.ES.4 per cent) amb pH 7% HEP4 prèviament. /5 per cent de CO2 durant 30 min. En aquestes condicions, les concentracions d'oxigen al medi d'incubació eren de 6,7 ± 0,5 µM mesurades amb un elèctrode d'oxigen tipus Clark [56,57].

Quan es va indicar, les neurones es van exposar a un precondicionament isquèmic (IPC; OGD curt durant 20 min seguit de 2 h de reoxigenació) abans de la isquèmia prolongada posterior (OGD, 90 min) i 4 h de reoxigenació (IPC més OGD / R) (Figura S1B). ). Paral·lelament, les neurones es van incubar en normòxia (Nx) a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada de 95 per cent d'aire / 5 per cent de CO2 o precondicionament isquèmic (IPC). Quan s'indica, les neurones es van incubar 30 min abans de l'IPC en una solució de Hanks tamponada (pH 7, 4), en absència o presència de wortmannina (100 nmol/L), tal com es va descriure anteriorment [19].

4.3. Transfeccions cel·lulars

Les neurones (8 DIV) o cèl·lules T HEK-293 es van transfectar amb un vector plasmidi que expressava Mdm2 marcat amb YFP del promotor humà MDM2. MDM2p/Mdm2-YFP va ser un regal d'Uri Alon i Galit Lahav (plasmidi Addgene # 53962, Watertown, MA, EUA) [58]. Quan calia, es va utilitzar un vector buit (pYFP) com a control en les mateixes condicions. La transfecció de plasmidis es va realitzar mitjançant Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, EUA), segons les instruccions del fabricant. Les cèl·lules es van transfectar amb 1, 5 µg/µL dels vectors plasmidis i es van utilitzar després de 24 h.

La derrota AKT en 6 neurones DIV es va aconseguir mitjançant la transfecció amb petits ribonucleòtids de doble cadena interferents (siRNA). Les seqüències orientades eren les següents: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisentit: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAgg–30 (ratolí, s62216, corresponent als nucleòtids 1006–1025, número d'accés GenBank NM{9}) [5{9}}). Com a control negatiu, hem utilitzat Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Tots els siRNA es van comprar a Ambion®, Invitrogen® i Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Alemanya). Segons el grau de derrocament de proteïnes, es va estimar que l'eficiència de la transfecció de siRNA era del 70 al 80 per cent als 3 dies posteriors a la transfecció. Per als experiments de silenciament, les neurones es van transfectar amb siRNA (10 nM) mitjançant Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), seguint les instruccions del fabricant. Les neurones es van incubar més en un medi neurobasal durant 72 h abans del seu ús.

4.4. Detecció citomètrica de flux de la mort de cèl·lules apoptòtiques

Les neurones es van separar acuradament de les plaques utilitzant sal tetrasòdica EDTA 1 mM en PBS (pH 7, 4) i es van tacar amb annexina V/APC i 7-AAD, fet exactament com es va descriure anteriorment [55].

4.5. Assaig d'activitat de caspasa-3

L'activitat de la caspasa-3 es va avaluar en lisats cel·lulars [33] i segons les instruccions del fabricant mitjançant el kit d'assaig fluorimètric CASP3F de SIGMA i es va llegir a l'emissió a una longitud d'ona de 405 nm. El mètode es basa en l'alliberament de la part fluorescent 7-amino4-metil cumarina (AMC). La concentració d'AMC es calcula mitjançant un estàndard AMC.

4.6. Immunoblots i assaig de co-immunoprecipitació

Les neurones es van lisar en tampó que contenia 1 per cent de SDS, 2 mM d'EDTA, 150 mM de NaCl, 12,5 mM de Na2HPO4 i 1 per cent de Triton X-100 (NP40: 1 per cent de NP40, EDTA diK més 5 mM, Tris pH{{13} }} mM, NaCl 135 mM i 10 per cent de glicerol) complementat amb inhibidors de la fosfatasa (1 mM de Na3VO4 i 50 mM de NaF) i inhibidors de la proteasa (100 mM de fluorur de fenilmetilsulfonil, 50 µg/mL anti-papaina, 50 µg/mL de pepstatin, 50 µg/mL). µg/mL d'amastatina, 50 µg/mL de leupeptina, 50 µg/mL de bestatina i 50 µg/mL d'inhibidor de tripsina de soja), emmagatzemat en gel durant 30 min i bullit durant 5 min. Les alíquotes d'extractes lisats es van sotmetre a gel de poliacrilamida SDS (MiniProtean®, Bio-Rad) i es van borrar amb anticossos durant la nit a 4 ◦ C. Els anticossos utilitzats van ser anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), caspasa anti-clivada-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; també detecta YFP) (Abcam, Cambridge, Regne Unit), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanya) i antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Regne Unit) durant la nit a 4 ◦C. Després de la incubació amb IgG anti-conill de cabra conjugada amb peroxidasa de rave picant (Pierce, Thermo Scientific) o IgG anti-ratolí de cabra (Bio-Rad), les membranes es van incubar immediatament amb SuperSignal West Dura (Pierce) de quimioluminescència millorada durant 5 minuts abans de l'exposició a Kodak. Pel·lícula XAR-5 durant 1 a 5 min i es van escanejar els autoradiogrames. Les intensitats de la banda es van quantificar mitjançant el programari ImageJ 1.48v, tal com es va descriure anteriorment [60].

Per a l'assaig de co-immunoprecipitació, les neurones es van lisar en tampó fred amb gel que contenia 50 mM de Tris (pH 7, 5), 150 mM de NaCl, 2 mM d'EDTA, 1 per cent de NP -40) ​​complementat amb inhibidors de la fosfatasa descrits anteriorment. Després de netejar els residus per centrifugació, els lisats neuronals (100 mg) es van incubar amb 1 mg d'anticossos durant 24 h a 4 ◦ C seguit de l'addició de 10 ml de proteïna A-agarosa (GE Healthcare Life Sciences) durant 2 h a 4 h. ◦C. Els immunoprecipitats es van rentar àmpliament amb tampó de lisi i es van resoldre mitjançant SDS-PAGE i es van immunoblotar amb els anticossos indicats [61]. Les abundàncies relatives de proteïnes es mostren a la figura S1. A la figura S3 s'inclouen taques completes i exploracions de gel.

4.7. Immunocitoquímica i Anàlisi d'Imatge

Les neurones es van cultivar en cobertors de vidre i es van fixar amb paraformaldehid al 4 per cent (p/v, en PBS) durant 30 min i es van immunocolorir amb anti-fosfoAKT de conill (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, EUA), ratolí anti-MDM2 (2A10, ab-16895), ratolí anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) [55], ratolí anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, EUA) i anti-GFP (1:1000; ab290; també validat per detectar YFP). L'immunomarcació es va detectar mitjançant anticossos secundaris anti-IgG-Cy3 de conill o IgG-Cy2 anti-ratolí (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, Regne Unit).

Els nuclis es van tacar amb 40,6-diamidino-2 fenilindol (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Els cobertors es van rentar, es van muntar en un reactiu antidecoloració lleuger SlowFade (Invitrogen) sobre portaobjectes de vidre i es van examinar amb un microscopi (microscopi invertit Nikon Eclipse Ti-E, (NY, EUA) equipat amb un objectiu de 40 ×, un il·luminador de fibra precentrat Nikon Intensilight). C-HGFI, i una càmera digital de dispositiu acoblat de càrrega en blanc i negre Hamamatsu ORCAER o un microscopi confocal làser d'escaneig ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tòquio, Japó) amb tres làsers de 405, 491 i 561 nm, equipat amb objectiu d'immersió en oli Apo de 40×, 63× i 100× per a imatges d'alta resolució i càmera digital del dispositiu Evolve Photometrics.

Tots els paràmetres del microscopi es van configurar per recollir imatges fluorescents per sota de la saturació i es van mantenir constants per a totes les imatges preses a l'experiment. Les imatges es van analitzar amb el programari ImageJ 1.48v (Instituts Nacionals de Salut). El percentatge de neurones p (Ser473) AKT plus i p53 plus i la quantificació de la intensitat màxima de fluorescència de proteïnes de p (Ser473) AKT i p53 es mostren a la figura S2A. A les neurones transfectades amb MDM2-GFP, la distribució nucleocitoplasmàtica de MDM2-GFP es va calcular com la relació entre la fluorescència mitjana nuclear i la fluorescència mitjana citoplasmàtica de MDM2 endògena, mesurada en 24 neurones (sis neurones per condició en quatre cultius neuronals diferents) (Figura S2B) [62].

Per quantificar la intensitat màxima de fluorescència nuclear de la tinció endògena de MDM2 i pSer473AKT, es van mesurar 40 neurones (10 neurones per condició en quatre cultius diferents) (figura S2C), tal com es va descriure anteriorment [44]. En els perfils d'intensitat transversal representatius que es mostren a la figura 5B, el percentatge de p (Ser473) AKT i MDM2 indicat a continuació de cada condició es va quantificar com a fluorescència mitjana nuclear. En tots els casos, els nuclis es van identificar mitjançant la tinció DAPI. La intensitat màxima de fluorescència nuclear MDM2 a les neurones tractades amb wortmannina o siAkt es mostra a la figura S2D.

4.8. Anàlisi estadística

Els resultats experimentals es van avaluar mitjançant una anàlisi de variància unidireccional, seguida de la prova post hoc de Bonferroni, utilitzada per comparar valors entre diversos grups. Els resultats s'expressen com a mitjanes ± SEM. La prova t de Student es va utilitzar per comparar dos grups de valors. En tots els casos, p < 0.05 es va considerar significatiu (* p < 0,05 versus Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Com protegeix Cistanche les neurones?

Hi ha algunes evidències que suggereixen que Cistanche pot protegir les neurones reduint l'apoptosi (mort cel·lular programada) i promovent la supervivència neuronal. L'apoptosi és un procés natural que es produeix a l'organisme per eliminar les cèl·lules danyades o no desitjades, però pot ser perjudicial quan es produeix de manera excessiva o inadequada. S'ha trobat que Cistanche inhibeix l'apoptosi en estudis de laboratori, i aquest efecte pot ajudar a protegir les neurones dels danys.

A més, Cistanche conté diversos compostos bioactius que s'ha demostrat que tenen efectes neuroprotectors. Per exemple, conté echinacòsid, que s'ha demostrat que protegeix les neurones de l'estrès oxidatiu i la inflamació. També conté acteòsid, que s'ha trobat que té propietats antiinflamatòries i antioxidants.

Referències

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Efecte del retard del tractament, l'edat i la gravetat de l'ictus sobre els efectes de la trombòlisi intravenosa amb alteplasa per a l'ictus isquèmic agut: una metaanàlisi de dades de pacients individuals d'assaigs aleatoris. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [Ref creuat]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Els atacs isquèmics transitoris previs poden tenir un efecte neuroprotector en pacients amb ictus isquèmic. Arc. Med. Ciència. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodríguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. La tolerància isquèmica neuronal està condicionada pel polimorfisme Tp53 Arg72Pro. Trad. Res del traç 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Stroke investigació en una cruïlla: demanar indicacions al cervell. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. El receptor gamma activat pel proliferador de peroxisomes participa en l'adquisició de la tolerància isquèmica cerebral induïda pel precondicionament isquèmic mitjançant el transportador de glutamat glial 1 in vivo i in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [Ref creuat]

6. Rodríguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Refocusing the Brain: New Approaches in Neuroprotection against Ischemic Injury. Neuroquimia. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Efecte del precondicionament isquèmic sobre la resposta genòmica a la isquèmia cerebral: semblança amb les estratègies neuroprotectores en estats d'hibernació i tolerants a la hipòxia. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [Ref creuat]

8. Gidday, JM Precondicionament cerebral i tolerància isquèmica. Nat. Reverent Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Fuga, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. El precondicionament proporciona neuroprotecció en models de malaltia del SNC: Paradigmes i significació clínica. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, Biomarcadors AM per al precondicionament isquèmic: trobar els responents. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [Ref creuat]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Segon, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulation of Cerebral Store-operated Calcium Entry-regulatory Factor (SARAF) and Peripheral Orai1 Following Focal Cerebral Ischemia and Preconditioning in Ratolins. Neurociència 2020, 441, 8–21. [Ref creuat]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novel Cellular Mechanisms for Neuroprotection in Ischemic Preconditioning: A View from Inside Organels. Davant. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Tolerància isquèmica induïda pel precondicionament: una finestra a l'engranatge endògen per a la protecció cerebral. Exp. Trad. Ictus Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Mecanismes apoptòtics després de la isquèmia cerebral. Ictus 2009, 40, 788–794. [Ref creuat]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide-3-Les vies de senyal de supervivència de la quinasa/Akt estan implicades en la supervivència neuronal després d'un ictus. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [Ref creuat]

16. Uzdensky, AB Regulació de l'apoptosi a la penombra després d'un ictus isquèmic: expressió de proteïnes pro i antiapoptòtiques. Apoptosi 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt és un objectiu molecular per a la teràpia de transducció de senyals en l'insult isquèmic cerebral. J. Pharmacol. Ciència. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. El paper de l'Akt (proteïna quinasa B) i la proteïna cinasa C en la lesió d'isquèmia-reperfusió. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP La inhibició de PTEN per peroxinitrit activa la via de senyalització neuroprotectora de la fosfoinosítid-3-quinasa/Akt. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [Ref creuat]

20. Manning, BD; Toker, A. Senyalització AKT/PKB: navegació per la xarxa. Cel·la 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Rols específics de les formes iso Akt en l'apoptosi i la regulació del creixement dels axons a les neurones. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [Ref creuat]

22. Santi, SA; Lee, H. Les isoformes Akt estan presents en diferents llocs subcel·lulars. Am. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [Ref creuat]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL El precondicionament isquèmic precoç requereix l'activació d'eNOS mediada per Akt i PKA mitjançant la fosforilació de serina1176. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Pinta, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Esdeveniments que promouen la supervivència i la mort després de la isquèmia cerebral transitòria: fosforilació d'Akt, alliberament del citocrom C i activació de proteases semblants a la caspasa. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Precondicionament en neuroprotecció: de la hipòxia a la isquèmia. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Una via de fosfatidilinositol 3-quinasa/Akt promou la translocació de Mdm2 del citoplasma al nucli. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2001, 98, 11598–11603. [Ref creuat]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforilació de HDM2 per Akt. Oncogen 2002, 21, 1955–1962. [Ref creuat]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu indueix la ubiquitinació de p53 mitjançant la fosforilació MDM2 mediada per Akt. Nat. Biol cel·lular. 2001, 3, 973–982. [Ref creuat]

29. Grossman, SR; Pérez, M.; Kung, AL; Josep, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM Els complexos p300/MDM2 participen en MDM2-Degradació mediada de p53. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [Ref creuat]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Regulació diferencial de la supervivència i la hipertròfia dels cardiomiocits per MDM2, una Ubiquitin Ligase E3. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [Ref creuat]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM El precondicionament isquèmic protegeix activant quinases de supervivència a la reperfusió. Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, regulació a la baixa de DM p53: un nou mecanisme molecular implicat en el precondicionament isquèmic. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [Ref creuat]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. La via MDM2-p53 està implicada en la tolerància neuronal a la isquèmia induïda pel precondicionament. Ciència. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G al promotor MDM2 determina el resultat funcional després de l'ictus. Ictus 2018, 49, 2437–2444. [Ref creuat]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Identificació d'una ser-473 quinasa amb motiu hidrofòbic PKB/Akt com a proteïna quinasa dependent de l'ADN. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [Ref creuat]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Excitotoxicitat i ictus: identificació de nous objectius per a la neuroprotecció. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; Enquadernador, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Paper of Phosphatidylinositol-3 Kinase Pathway in NMDA Preconditioning: Diferents Mecanismes per a convulsions i degeneració neuronal de l'hipocamp induïda per l'àcid quinolínic. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [Ref creuat]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Les isoformes protegeixen de manera diferenciada contra la lesió neuronal induïda per l'ictus mitjançant la regulació de les activitats mTOR. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [Ref creuat]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Les dosis de precondicionament de NMDA promouen la neuroprotecció millorant l'excitabilitat neuronal. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [Ref creuat]

40. Grabb, MC; Choi, DW Tolerància isquèmica en cultiu de cèl·lules corticals murines: paper crític per als receptors NMDA. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [Ref creuat]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Funcions diferencials dels subtipus de receptors NMDA en la mort de cèl·lules neuronals isquèmiques i la tolerància isquèmica. Ictus 2008, 39, 3042–3048. [Ref creuat]

42. Gómez-Sànchez, JC; Esteban, MD; Rodríguez-Hernández, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. El polimorfisme humà Tp53 Arg72Pro explica diferents pronòstics funcionals en l'ictus. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [Ref creuat]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. El factor neurotròfic derivat d'astròcits mesencefàlics (MANF) protegeix contra l'apoptosi neuronal mitjançant l'activació de la via de senyalització Akt/MDM2/p53 en un model de rata d'hemorràgia intracerebral. Davant. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 promou la supervivència neuronal i la recuperació funcional després d'un ictus. Ciència. Adv. 2020, 6, eabc5702. [Ref creuat]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jiménez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Feditxev, PO; et al. L'orientació a PFKFB3 alleuja la lesió cerebral per isquèmia-reperfusió en ratolins. Ciència. Rep. 2019, 9, 1–13. [Ref creuat]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallate indueix l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular G2 a través de la via Akt/MDM2/p53 en cèl·lules de càncer d'ovari resistents al cisplatí A2780/CP70. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Sí, X. L'ARN LINC01125 sense codificació llarg induït per LXR-623-suprimeix la proliferació de cèl·lules de càncer de mama mitjançant la via de senyalització PTEN/AKT/p53. Mort cel·lular Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin atenua els dèficits locomotors i cognitius, així com la lesió neuronal de l'hipocamp mitjançant la via de senyalització PI3K/Akt1/GSK-3 en un model in vivo d'isquèmia cerebral. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Alteracions d'Akt1 (PKB) i p70S6K en isquèmia focal transitòria. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1 i NCX3: dos nous efectors del precondicionament retardat en la isquèmia cerebral. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [Ref creuat]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Regulació de l'estabilitat MDM2 després del dany de l'ADN. J. Cèl·lula. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [Ref creuat]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Identificació i caracterització de múltiples proteïnes mdm-2 i complexos de proteïnes mdm-2-p53. Oncogen 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA La fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Akt millorada té objectius pleiotròpics a les neurones de l'hipocamp exposades a l'estrès oxidatiu induït pel ferro. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. El tràfic de p53 mitocondrial-nuclear controla la susceptibilitat neuronal en l'ictus. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 coordina la neurogènesi i la mida cortical durant el desenvolupament. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC El paper dels receptors NMDA en el desenvolupament de la resistència cerebral mitjançant el precondicionament i el postcondicionament. Envelliment Dis. 2014, 5, 430–441. [Ref creuat]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM La privació d'oxigen i glucosa indueix disfunció mitocondrial i estrès oxidatiu a les neurones, però no als astròcits en cultiu primari. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [Ref creuat]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dinàmica del bucle de retroalimentació p53-Mdm2 en cel·les individuals. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [Ref creuat]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP impulsa l'inici, la progressió i la metàstasi del tumor de mama en ratolins i és un objectiu terapèutic potencial. J. Clin. Investig. 2011, 121, 4655–4669. [Ref creuat]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gómez-Sànchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforila Cdh1 i modula l'estabilitat de la ciclina B1 en excitotoxicitat. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [Ref creuat]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. La regulació de la interacció de la sintasa Bcl-xL-ATP per la ciclina mitocondrial B1-quinasa dependent de la ciclina-1 determina la supervivència neuronal. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-La via Rock2 controla la integritat i la memòria dendrítiques. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]