L'extracte metanòlic d'espinacs atenua la degeneració de la retina en rates amb diabetis
Jun 22, 2022
Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació
Resum:S'ha suggerit que l'extracte metanòlic d'espinacs (SME) inhibeix la formació de productes finals de glicació avançada (AGE), que s'incrementen durant la progressió de la diabetis, per la qual cosa és important saber si les pimes tenen efectes beneficiosos sobre la retina diabètica. En aquest estudi, els assajos in vitro van demostrar que la SME inhibeix la glicació, la formació de grups carbonil i l'esgotament del grup tiol reduït a l'albúmina sèrica bovina incubada amb sucres reductors o metilglioxal. També es va estudiar l'efecte SME a les retines de rates diabètics induïdes per estreptozotocina (STZ2) (n=10) en el grup normoglucèmic, STZ, rates STZ tractades amb SME i rates STZ tractades amb aminoguanidina (referència anti-AGEs). grup) durant 12 setmanes. La retina es va seccionar i es va immunocolorir per Ne-carboximetil lisina (CML), receptor RAGE, NADPH-Nox4, òxid nítric sintasa inducible (iNOS), 3-nitrotirosina (NT), NF-kB nuclear, factor de creixement endotelial vascular ( VEGF), proteïna àcida fibril·lar glial (GFAP), proteïna S100B i assaig TUNEL. La peroxidació lipídica es va determinar a tota la retina mitjançant els nivells de malondialdehid (MDA). Els resultats van mostrar que a la retina diabètica, SME va reduir la co-localització de CML-RAGE, l'estrès oxidatiu (NOX4, iNOS, NT, MDA), la inflamació (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) i l'apoptosi (p).<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">
Paraules clau:espinacs; retinopatia diabètica; productes finals de glicació avançada; estrès oxidatiu; inflamació; RÀBIA; carboximetil L-lisina
Feu clic aquí per saber-ne més
1. Introducció
Les dietes a base de plantes s'han associat amb un menor risc de desenvolupar malalties cròniques com l'obesitat, la diabetis tipus 2 i les malalties coronàries. Els espinacs (Spinacia oleracea L.) són una verdura de fulla comestible que es consumeix a tot el món perquè aporta una quantitat apreciable de fibres, vitamines i minerals [1,2]. S'han identificat diversos dels seus fitoquímics, com ara clorofil·les, carotenoides (luteïna i zeaxantina) [3] i compostos fenòlics (flavones, flavonoides, cumarines) [4-8] (vegeu el suplement 1). S'ha informat que els espinacs, quan s'ingereixen com a aliment, extracte soluble en aigua o liofilitzats, i els seus tilacoides tenen propietats anticancerígenes, contra l'obesitat i hipoglucèmiants [9]. L'efecte antiinflamatori dels espinacs s'ha demostrat en models d'endotoxèmia animals, animals obesos i humans sans [9]. El seu efecte antioxidant es va estudiar en cèl·lules de carcinoma de pròstata humà, models animals amb obesitat, ratolins irradiats amb UV i adenocarcinoma de pròstata de ratolí transgènic [9,10]. Els efectes antiglicació i antiinflamatoris de l'extracte metanòlic d'espinacs (SME) s'han estudiat en el model de diabetis induïda per glucosa en peix zebra i necrosi miocàrdica induïda per isoproterenol en rates, respectivament [11,12]. SME va disminuir els nivells d'hemoglobina glicosilada i fructosamina, inclosos els nivells de proteïna glicada, reduint l'activitat de l'aldosa reductasa a la lent ocular [11]. Les troballes anteriors suggereixen que les pimes poden tenir un efecte preventiu sobre la progressió de les complicacions de la diabetis mellitus com la retinopatia diabètica (RD).
La DR condueix progressivament a la pèrdua d'agudesa visual o ceguesa que s'ha relacionat amb la inflamació, l'estrès oxidatiu i l'acumulació de productes finals de glicació avançada (AGE) [13,14]. Els AGE indueixen la reticulació de proteïnes, alterant l'estructura/funció i el seu volum de negoci/aclaració. Els AGE es poden produir mitjançant una reacció no enzimàtica entre la glucosa amb un grup amino lliure de proteïnes, formant intermedis reversibles com les bases de Schiff i els productes Amadori (fructosamina)[15]. Altres mecanismes per a la formació d'AGE inclouen la via "estrès carbonílic", on l'oxidació de sucres i lípids crea compostos intermedis dicarbonil com el glioxal i el metilglioxal (MGO), que condueixen a la formació d'AGEs com a N:-carboximetil lisina (CML)[ 16]. L'augment dels nivells de CML en sèrum i vitri pot ser un marcador bioquímic tant per a l'aparició com per a la progressió de la RD [17, 18]. A la retina, l'activació del receptor RAGE per AGEs (AGEs-RAGE) indueix la sobreexpressió de la proteïna àcida fibril·lar glial (GFAP) i factors proinflamatoris, regulats pel factor nuclear kappa-potenciador de la cadena lleugera de B activat. cèl·lules (NF-kB)[19]. NF-kB regula positivament l'expressió RAGE actuant com a mecanisme de retroalimentació positiva [20].què és cistancheD'altra banda, altes concentracions de S100B, una proteïna que s'uneix al calci, també poden activar NF-kB, induint neuroinflamació i activació de cèl·lules glials [21]. La sobreexpressió de S100B en astròcits provoca efectes neurotòxics manifestats per astrogliosi retiniana [22].
Cistanche pot anti-envelliment
S'han desenvolupat experimentalment estratègies per prevenir el dany a la retina. Alguns fitoquímics d'espinacs aïllats d'altres plantes s'han associat amb la inhibició dels AGE i l'estrès oxidatiu [8,23-26]. La luteïna, l'astaxantina i el kaempferol han protegit les cèl·lules epitelials pigmentàries de la retina derivades d'humans (ARPE-19) del dany mitjançant les seves propietats anti-AGE, antioxidants i anti-apoptosi [26-28]. Aquests resultats suggereixen que els fitoquímics dels espinacs tenen un paper rellevant en la prevenció de la degeneració de la retina com la DR. Una altra estratègia ha estat utilitzar l'aminoguanidina (AG) com a potent inhibidor de la glicació i l'activitat iNOS, atenuant l'acumulació de CML i la formació de precursors dicarbonílics reactius en rates [29]. Tanmateix, en un assaig clínic multicèntric i aleatoritzat amb 690 pacients diabètics, l'efecte beneficiós no es va establir clarament [30].
Els canvis en la degeneració de la retina en condicions d'hiperglucèmia han estat poc estudiats. Per tant, és interessant saber si la SME protegeix les capes de la retina dels danys relacionats amb les seves propietats anti-AGE, antioxidants i antiinflamatòries a la retina de rates diabètics induïdes per estreptozotocina.
2. Materials i Mètodes
2.1.Preparació de l'extracte metanòlic d'espinacs (SME)
Les fulles fresques d'espinacs (S.oleracea L.) es van collir durant la temporada de tardor-hivern en un camp agrícola de la província de Puebla, Mèxic, i es van identificar per un botànic a l'herbari de l'Institut Politècnic Nacional (IPN, Ciutat de Mèxic, Mèxic). L'exemplar del val número 4532 es va dipositar a l'herbari de l'Escola Nacional de Ciències Biològiques de l'IPN.
Les fulles estaven deshidratades i ben mòltes. Les fulles seques es van macerar amb metanol a temperatura ambient, es van filtrar a través de filtres de cel·lulosa (Whatman, Maidstone, Regne Unit) i es van assecar amb un evaporador rotatori al buit (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Suïssa) a 45 graus per donarà una goma verda (95,0 g/kg de fulles seques).Cistanche anti-envellimentEl SME es va emmagatzemar a la foscor a 4 graus fins al seu ús. Per a tots els assajos, l'extracte es va reconstituir en aigua destil·lada [11].
2.2.Assajos in vitro de l'activitat antiglicació de les pimes
2.2.1. Formació de productes finals de glicació avançada derivats de l'albúmina sèrica bovina (BSA-AGEs)
Es va dur a terme l'assaig BSA-AGEs, tal com es va descriure anteriorment [31]. Breument, 10 mg/mL de BSA (fracció V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) es va afegir en D-glucosa 0, 5 M, D-fructosa {{12 }},5 M, o metilglioxal 2,5 mM, i es fa en una solució 0,1 M PBS (pH 7,4) i 0,02 per cent d'azida de sodi. Es van afegir concentracions de SME (5, 10, 25, 50, 100 i 200 mg/mL) a cada mescla i després es van incubar a 37 graus durant 4 setmanes. Després, els sucres no reaccionats es van eliminar mitjançant diàlisi contra aigua destil·lada durant dos dies a 4 graus. Els nivells de BSA-AGE es van determinar mitjançant espectrofotometria de fluorescència (Ex370/Em 440 nm; model LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, Regne Unit) [32]. La glicació de la proteïna BSA mitjançant la reducció de sucres i MGO va ser un control positiu (BSA glicat), mentre que la incubació de la BSA glicada amb aminoguanidina (1 mg/mL) es va utilitzar com a control negatiu (BSA glicada-AG). Els assajos es van realitzar per triplicat.
2.2.2. Assaig de fructosamina
El nivell de fructosamina es va determinar mitjançant l'assaig de tetrazoli blau nitro (NBT) [33], que es basa en la capacitat de la fructosamina de reduir NBT, formant formazan, un producte final de color en condicions alcalines. Es van afegir deu microlitres de qualsevol dels controls o concentracions de SME incubades amb BSA glicada (BSA-SME) a 9 0 μL de NBT a 2,5 mM, preparats en un tampó de carbonat (0,1 M; pH 10,3); tots es van incubar a 37 graus C durant 30 min. Es va mesurar l'absorbància a 530 nm. Les concentracions de fructosamina (nmol/mg) es van calcular segons una corba estàndard de formazà.
2.2.3. Determinació de la formació de grups carbonil i l'esgotament de grups tiol en BSA-AGEs
La concentració del grup carbonil es va mesurar en mostres BSA-SME i controls, segons Levine et al. [34]. Es va afegir una solució de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH; 10 mM) en 400 μl de HCl 2,5 M a 100 μl de cada mostra i es va incubar a la foscor durant 60 min a temperatura ambient.cistanche beneficisA continuació, es van afegir 500 μL d'àcid tricloroacètic (20 per cent p/v) i es van mantenir en gel durant 5 min. Les mostres es van centrifugar a 4000 rpm durant 15 min i el pellet de proteïnes es va rentar tres vegades amb acetat d'etil/etanol (1: 1 v/v). Després, les mostres es van suspendre en 250 μL de clorhidrat de guanidina a 6 M. La concentració de grups carbonil (nmol/mg de proteïna) es va calcular per espectrofotometria a 370 nm d'absorbància (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, EUA) mitjançant el coeficient d'absorció de DNPH (22.000 M-1 cm{-1).
Segons el mètode d'Ellman, es va realitzar la determinació de l'esgotament del grup tiol en BSA-SME i mostres de control. Breument, es va incubar 10 μL de 5,5'-Disulfanediylbis (2-àcid nitrobenzoic) (DNTB; 10 mM, preparat en PBS) amb 50 μL de mostres glicadas durant 15 min a temperatura ambient, després es va mesurar l'absorbància a 410 nm. El nivell de grups tiol lliure es va calcular mitjançant una corba estàndard de L-cisteïna (0.4-11 μM) i es va expressar en nmol/mg de proteïna [34].
2.3. Efecte de la SME a la retina de rates diabètics 2.3.1. Inducció de la diabetis a les rates
Es van utilitzar rates mascles Wistar amb un pes de 250 ± 10 gr (N=40) en dejú durant 8 h. Es va administrar una dosi intraperitoneal d'estreptozotocina (60 mg/kg) en tampó de citrat (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EUA) [35]. Tres dies després, es va mesurar el nivell de glucosa (glucòmetre; ACCU-CHEK actiu; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemanya) recollint una gota d'una mostra de sang de la cua. Es van reclutar animals amb nivells glucèmics superiors a 350 mg/dL per a l'estudi. La glucosa a la sang es va mesurar setmanalment durant 12 setmanes.
2.3.2. Disseny experimental
Les rates diabétiques induïdes per estreptozotocina (STZ) es van dividir aleatòriament en els grups següents (n =10): STZ tractada intragàstricament amb 2 ml d'aigua potable (STZ); STZ tractat amb SME a 400 mg/kg (STZ-SME); rates normoglucèmiques (NG); i STZ tractat amb 50 mg/kg d'aminoguanidina (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG es va utilitzar com a grup de referència anti-AGE. Les dosis assignades es van administrar cada 24 hores (9:00 a. m.) durant 12 setmanes. El nivell glucèmic de tots els grups es va controlar setmanalment. El règim de dosificació SME a 400 mg/kg es va basar en el següent: s'obtenen 7 g de SME a partir de 100 g d'espinacs frescos (dades no mostrades). Aquesta quantitat equival al consum diari d'una persona mitjana de 70 kg en la dieta americana [36], que correspon a 100 mg d'extracte/kg de pes corporal.Extracte de Cistanche Anti RadiacióD'altra banda, a causa de la diferència en el metabolisme accelerat de les rates, es recomana augmentar el consum de qualsevol extracte natural fins a 6,4 vegades per a estudis de comparació amb humans [37]. La dosi de 400 mg/kg que vam utilitzar es va basar principalment en els resultats obtinguts en un model de necrosi miocàrdica induïda en rates Wistar, que va demostrar que l'efecte antiinflamatori de la SME és més significatiu a 300 mg/kg [12].
2.3.3. Avaluacions histològiques i d'immunohistoquímica
Els ulls enucleats es van fixar en formalina neutra i després es van deshidratar en alcohols graduats i es van incrustar en parafina. Les seccions histològiques de 2 μm es van muntar en portaobjectes electrocarregats, es van desparafinar i es van rehidratar fins a una solució de recuperació d'antigen (K035; tampó de citrat 10 ×, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, EUA). Es va utilitzar un sistema d'immunodetecció basat en polímers (sistema de detecció DAB PolyVuemouse/conill, Diagnostic BioSystems). Es van utilitzar els anticossos primaris següents: proteïna àcida fibril·lar glial (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, EUA); factor de creixement endotelial vascular (anti-VEGF; sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EUA), proteïna B d'unió al calci S100 (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, Regne Unit) i el factor nuclear kappa-potenciador de la cadena lleugera de cèl·lules B activades (anti-NF-kB p65; sc-8008). Totes les dilucions es van fer a 1:200 i es van incubar durant la nit a 4 graus. Es va afegir un anticòs secundari (Mouse/Rabbit PolyVueTM) segons les instruccions del proveïdor.cistanche herbaLes seccions es van tenyir amb substrat DAB plus/cromogen i hematoxilina. Les observacions histològiques i la captura d'imatges es van realitzar en un microscopi Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanya).
Per a la tinció d'immunofluorescència, les diapositives es van incubar durant la nit a 4 graus C amb els anticossos primaris següents: carboximetil lisina (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, Regne Unit), receptor AGE (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oxidasa 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotirosina (anti-NT; ab110282) i òxid nítric sintasa (inductible) (anti-iNOS; A00368-1;Boster Bio, Pleasanton, CA , EUA). Aleshores, es van utilitzar els anticossos secundaris següents: per a anti-RAGE, conjugat amb lgG(FITC) de cabra anti-ratolí (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); per a anti-LMC i anti-NT, IgG-PE anti-conill de ratolí (SC-3753); i per a anti-iNOS i anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Tots es van incubar a temperatura ambient durant 60 min. Després, es van muntar seccions en un medi que contenia diclorhidrat de 4',6-diamidina-2'-fenilindol (DAPI). Els anticossos anti-CML i anti-RAGE es van co-hibridar a la mateixa diapositiva. Es va utilitzar l'estació d'imatge de cèl·lules FLoidTM (Life technologies Carlsbad, San Diego, CA, EUA) per a imatges de fluorescència.
2.3.4.Avaluació de l'apoptosi
L'apoptosi de les cèl·lules de la retina es va detectar segons el manual descrit per l'assaig d'etiquetatge de nick-end (TUNEL) mediat per desoxinucleotidil transferasa (TdT) mediada per desoxiuridina trifosfat (dUTP) mitjançant el kit de detecció de mort cel·lular in situ, TMR (tetrametil-rodamina{{ 3}}dUTP) vermell, versió 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Breument, les diapositives desparafinades es van rehidratar i es van esbandir dues vegades amb PBS. A continuació, es van incubar amb la barreja de reacció TUNEL en una atmosfera humidificada durant 60 min a 37 C. Posteriorment, es van muntar seccions amb DAPI i es van observar en microscòpia de fluorescència (FLoidTM Cell Imaging Station). Es va calcular IOD per a TUNEL per a les capes de la retina.
2.3.5. Assaig de peroxidació de lípids
Per a l'avaluació dels nivells de malondialdehid (MDA) al teixit de la retina, aproximadament 3 mg de teixit fresc (n=3) es van homogenar i processar tal com es va informar anteriorment [38]. Els nivells de MDA es van quantificar seguint les instruccions del proveïdor del kit (kit d'assaig OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, EUA).
2.4.Anàlisi estadística
Per a l'anàlisi estadística, es van capturar totes les micrografies de la retina amb una magnitud de 200× a 100 μm més enllà de la regió del nervi òptic. Es van analitzar aproximadament 40 imatges per grup d'animals (n=7). L'anàlisi d'imatges es va realitzar amb el programari Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, EUA). Hem utilitzat el programari GraphPad Prism (La Jolla, CA, EUA; versió 8.0). Les xifres mostren valors gràfics en gràfics de caixa i bigotis (mediana, primer terç quartil, valor mínim-màxim) per a la capa de cèl·lules ganglionars (GCL), la capa nuclear interna (INL) i la capa nuclear externa (ONL). La mitjana i la desviació estàndard (mitjana ± SD) es mostren a l'apèndix A (taules A1-A3). En tots els casos, es va realitzar una prova ANOVA unidireccional seguida de la prova de Tukey. pàg<0.05 was="" considered="" statistically="">
