La tetrandrina alleuja la lesió dels podòcits mitjançant el bloqueig de senyalització de Calpain-1 dependent del calci

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu i Jin Yu*

Resum

Antecedents:Els podòcits s'han convertit en un objectiu crucial per a les intervencions en proteïnesronyómalalties. Molts estudis han informat que la sobreexpressió de la proteïna 6 del canal catiònic potencial del receptor transitori (TRPC6) en la lesió dels podòcits regula a l'alça el Ca2 intracel·lular més l'afluència i estimula la senyalització de la proteasa calpaïna-1 de Ca2 més dependent de Ca2. El fàrmac tradicional xinès, la tetrandrina, un bloquejador de canals de Ca2 més no selectiu, s'ha utilitzat durant molt de temps per tractar la malaltia crònica.ronyómalaltia. Aquesta investigació pretenia explorar els possibles mecanismes subjacents a les propietats antiproteinúriques de la tetrandrina.

Mètodes:Es va investigar la implicació de la tetrandrina en la senyalització de Ca2 més calpain-1 dependent de podòcits de ratolí i rates de nefropatia induïda per adriamicina. La ciclosporina A (CsA) i l'U73122 es van utilitzar com a controls positius. Es van examinar la viabilitat cel·lular, la citotoxicitat, la concentració de Ca2 més, l'activitat de la calpaïna i els nivells d'ARNm i d'expressió de proteïnes de les vies de senyalització de la calpaïna-1. Es van mesurar els canvis clínics i patològics.

Resultats:La tetrandrina va disminuir el Ca2 intracel·lular més l'afluència en podòcits6-que sobreexpressen TRPC cultivats. Tant en estudis in vitro com in vivo, l'administració de tetrandrina va regular a la baixa l'activitat de la calpaïna i l'expressió de calpaïna-1 i va restaurar l'expressió de la Talin-1 i la nefrina aigües avall. En comparació amb CsA, el tractament amb tetrandrina va mostrar efectes inhibidors superiors sobre l'activitat de la calpaïna i l'expressió de calpaïna-1.

Conclusions:La tetrandrina té un potencial terapèutic en el dany dels podòcits en bloquejar l'activació depenent del Ca2 més de la via de senyalització de la calpaïna-1. La tetrandrina va reduir la proteinúria, va millorar la funció renal i va alleujar el dany patològic renal.

Paraules clau:Tetrandrina, lesió dels podòcits, proteïna 6 del canal catiònic potencial del receptor transitori, calpaina-1

Cistanche tubulosa prevé la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra

Fons

Els podòcits són un requisit previ per mantenir la permeabilitat selectiva de la barrera de filtració glomerular i la integritat estructural glomerular. La lesió dels podòcits s'associa normalment amb malalties renals proteïnúriques, com ara glomeruloesclerosi focal segmentària (FSGS), nefropatia membranosa, malaltia de canvi mínim i diabetis.ronyómalaltia [1-4]. La protecció i restauració dels podòcits de factors nocius constitueixen un repte important en el tractament amb èxit de la malaltia renal.

Els podòcits són cèl·lules molt especialitzades, diferenciades terminalment, situades fora de la membrana basal glomerular i caracteritzades per processos del peu. La disfunció de la regulació de la senyalització del calci en els podòcits condueix a la desorganització del citoesquelet de l'actina dels podòcits, la alteració del procés del peu, la interrupció del diafragma de l'escletxa i la proteinúria. La proteïna 6 del canal catiònic potencial del receptor transitori (TRPC6), una nova proteïna associada al diafragma d'escletxa en els podòcits, s'ha identificat com un canal iònic conductor de Ca2 més inespecífic [5–8]. L'expressió glomerular de TRPC6 augmenta en moltes malalties proteïnúriques hereditàries i adquirides. Estudis anteriors han informat que la sobreexpressió de TRPC6 en podòcits desencadena un augment superior de Ca2 intracel·lular més afluència, que es creu que és responsable de la lesió de cèl·lules podòcits. L'augment de la càrrega de calci dins dels podòcits activa les vies de senyalització aigües avall, incloses la calpaina-1, la talina-1, la nefrina i la calcineurina, per modular l'activitat o l'expressió dels gens diana [9–12]. Fangji Huangqi Tang és una medicina tradicional xinesa clàssica (TCM) per al tractament de la síndrome nefròtica [13]. Es compon de sis herbes: Radix Stephania Tetrandra (les arrels de Stephania tetrandra), Radix Astragali (les arrels d'Astragalus membranaceus), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (les arrels d'Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhizae (les arrels de Glycyrrhizis), Rhizoma uraleningsisiberisi (les arrels de Zingiber Officinale) i Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus de Ziziphus jujuba) [1]. La tetrandrina, un dels principals components actius de Radix Stephania Tetrandra, un bloquejador de canals de Ca2 més no selectiu, s'ha provat en assaigs clínics i s'ha indicat per alleujar la proteinúria i millorar la funció renal [14, 15]. Un estudi anterior va demostrar els efectes de bloqueig de la tetrandrina en la senyalització RhoA dependent de Ca2 més en podòcits [16], però els mecanismes subjacents no es van dilucidar. Aquí, es van desenvolupar models de sobreexpressió de TRPC6-in vitro i in vivo. Després de l'administració de tetrandrina, es van avaluar els canvis en la senyalització de Ca2 depenent de TRPC6-, incloent-hi dianes aigües avall, calpaina-1, Talin-1, nefrina i calcineurina. La ciclosporina A (CsA), un inhibidor de la calcineurina, àmpliament utilitzat en el tractament de malalties de la proteinúria) [17] i U73122, un inhibidor de l'obertura del canal TRPC6 [18] es van utilitzar com a controls positius.

Mètodes

Cultiu cel·lular i construcció de plasmidis

Les cèl·lules de la línia cel·lular de podòcits de ratolí (MPC5) immortalitzades condicionalment, obtingudes del professor Peter Mundel (Mount Sinai School of Medicine, EUA), es van mantenir a 33 graus per a la proliferació i després es van canviar a 37 graus per a la diferenciació. El plasmidi d'expressió TRPC6 es va construir clonant la longitud completa de la seqüència d'ADN codificant del gen TRPC6 als llocs EcoRI/BamHI del vector pCDH-GFP-PURO i empaquetat en lentivirus. Quan es van diferenciar i es van fer créixer fins a un 80% de confluència, els podòcits es van sembrar a una densitat cel·lular de 4 × 104 per cm2 i es van incubar en combinació amb lentivirus que sobreexpressa TRPC{11}}. La línia cel·lular estable TRPC6, verificada mitjançant l'expressió de la proteïna TRPC6 i l'ARNm, es va utilitzar per a més experiments. Així, els podòcits MPC5 es van dividir en tres grups, el grup de control normal (NC), el grup de lentivirus en blanc (Lv-NC) i el grup de sobreexpressió TRPC6-(OverTRP).

Tractament amb fàrmacs cel·lulars in vitro i assaig de citotoxicitat

Es va accedir a la viabilitat cel·lular mitjançant l'assaig del kit de recompte de cèl·lules {{0}} (CCK-8), segons les instruccions del fabricant. Es van cultivar un total de 5000 podòcits MPC5 per pou per triplicat en plaques de 96-pous. Les cèl·lules es van tractar amb una sèrie de CsA (0–2 μmol/L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) i tetrandrina (0–40 μmol/L; Sigma Aldrich) a 37 graus durant 48 h. Després es va afegir CCK-8 a les plaques (10 μL/pou), que després es van incubar a les fosques durant 2 h. Es va mesurar l'absorbància a 450 nm mitjançant un lector de microplaques (BioTek Instruments, EUA). La citotoxicitat es va analitzar mitjançant la quantificació de l'alliberament de lactat deshidrogenasa (LDH) mitjançant el kit d'assaig de citotoxicitat LDH-WST (Laboratoris Dojindo, Japó). Com a control positiu, les cèl·lules es van tractar amb 10 μmol/LU73122 (Cal biochem, EUA) a 37 graus durant 10 minuts.

Extracció d'ARN i reacció en cadena quantitativa transcriptasa inversa-polimerasa (qRT-PCR)

L'ARN total es va preparar a partir de cèl·lules cultivades ironyóteixits utilitzant el reactiu RNAiso Plus (Takara, Japó) i transcrits inversament al kit cDNA PrimeScript™ RT Master Mix (Takara) segons el protocol dels fabricants. qRT-PCR es va realitzar mitjançant Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Alemanya). Les seqüències d'imprimació dels gens diana i de referència s'enumeren a la taula complementària S1. Les dades es van recollir mitjançant el sistema de PCR en temps real ABI Prism 7900HT FAST. La quantificació relativa de l'expressió gènica objectiu es va normalitzar mitjançant el mètode comparatiu 2-ΔΔCt. Es va utilitzar la gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) com a control intern.

Western blotting

es van extreure mostres de proteïnes totals de cèl·lules cultivades ironyóteixits. Les concentracions de proteïnes es van determinar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (Thermo Fisher Scientific). Les mostres es van separar en un gel de poliacrilamida-dodecil sulfat de sodi al 10% i es van transferir a una membrana de difluorur de polivinilidè. A continuació, es va bloquejar la membrana durant la nit a 4 graus amb anticossos primaris, és a dir, anti-TRPC6 (Santa Cruz, EUA), dolor anti-cal-1 (Abcam, Regne Unit), anti-Talin-1 (Abcam) , antinefrina (Santa Cruz) i anticalcneurina (Abcam). Després del rentat, la membrana es va incubar amb IgG anticonill de cabra (H més L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, EUA). La membrana també es va processar per detectar GAPDH (Abcam) per a una càrrega igual. Es van visualitzar les bandes reconegudes per l'anticòs primari i es van analitzar les densitats òptiques de les bandes de proteïnes mitjançant el programari TanonImage (Tanon, Xina).

Determinació del Ca2 citosòlic més en podòcits cultivats Els podòcits MPC5 es van sembrar i es van tractar amb tetrandrina, CsA i U73122 durant 48 h, 48 h i 10 min, respectivament. A continuació, els podòcits es van incubar amb RPMI-1640 suplementat amb 10μM Fluo-3AM (Laboratoris Dojindo) durant 30 minuts a la foscor. A continuació, es van rentar immediatament amb solució salina tamponada amb fosfat, en la qual es van mantenir i excitar a 488 nm. La concentració relativa de Ca2 citosòlic més ió es va avaluar mesurant la intensitat de la fluorescència mitjançant un sistema d'imatge confocal làser Zeiss (Zeiss, EUA).

Mesura de l'activitat de la calpaïna

L'activitat de Calpain es va determinar mitjançant el kit d'assaig d'activitat de Calpain d'Abcam Inc., segons el protocol del fabricant. El sobrenedant (150 uL) dels podòcits oronyóEls teixits es van prendre en la solució tampó adequada (145 mmol/L Nacl, 100 mmol/L Tris-HCL, pH 7,3) i 0,15 mLN-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L). Després d'una incubació de 1-h a 37 graus a la foscor, les mostres es van llegir amb un fluoròmetre equipat amb un filtre d'excitació de 360 ​​nm i un filtre d'emissió de 440 nm.

Model de rata de nefropatia induïda per adriamicina (ADRN) Basant-se en l'aproximació de Fermi de la mida de la mostra [19] i la diferència de proteinúria entre els grups de control i model dels nostres experiments preliminars, es va determinar el nombre total de rates requerides en el nostre estudi. Un total de 56 rates Sprague-Dawley mascles sans, amb un pes aproximat de 200 g i unes 8 setmanes d'edat (Institut de Zhejiang de TCM), es van dividir aleatòriament en set grups (n =8 rates/grup), és a dir, el grup ADR, ADR més grup de dosis baixes de tetrandrina (4 mg/kg/d), grup de dosis mitjanes ADR més tetrandrina (8 mg/kg/d), grup de dosis altes de ADR més tetrandrina (16 mg/kg/d), grup tractat d'ADR més CsA (30 mg). /kg/d), ADR més dosi mitjana de tetrandrina (8mg/kg/d) en combinació amb el grup CsA (30mg/kg/d) i el grup NC. Les rates del grup model i els grups de tractament amb fàrmacs es van anestesiar amb una injecció intraperitoneal de clorhidrat de ketamina (50 mg/kg) i es van injectar dues dosis d'ADR (4 mg/kg) a la vena caudal per desenvolupar el model de rata FSGS. Després de 12 setmanes, es van recollir mostres d'orina de les rates durant 24 hores mitjançant gàbies metabòliques, seguides de la recollida de sang i la collita de laronyons. Es va observar l'eficàcia clínica i es van mesurar els canvis en els nivells de proteïnes d'orina 24-h, albúmina plasmàtica, creatinina sèrica (Scr) i nitrogen de l'orina en sang (BUN) mitjançant equips de diagnòstic disponibles comercialment amb un analitzador químic automatitzat (HITACHI 7180). ).

Tots els procediments experimentals que impliquen l'ús d'animals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica d'Experiments amb Animals de l'Institut de Zhejiang de TCM (Tianmushan Road No.132) i es van realitzar estrictament d'acord amb els principis descrits a la Guia del NIH per a la cura i l'ús d'animals de laboratori. .

Tinció histològica, microscòpia electrònica i anàlisi

rataronyonses van fixar en paraformaldehid, es van deshidratar mitjançant una sèrie graduada d'etanol i es van incrustar en parafina. Les seccions (5-μm de gruix) es van tacar amb hematoxilina i eosina (H&E) i tricrom de Masson i es van examinar amb un microscopi òptic. Els ronyons es van perfondre i es van fixar amb glutaraldehid i després es van tallar en blocs de teixit de 1-mm3 per incrustar epoxi. La microscòpia electrònica es va realitzar mitjançant procediments estàndard. Es van obtenir cinc ultramicrografies aleatòriament de cada exemplar. La taxa de fusió dels processos del peu del podòcit (PFR) es va calcular mitjançant la fórmula següent: PFR (per cent)=∑LFP / ∑LBM×100 per cent, on ∑LFP és la longitud total del procés del peu fusionat i ∑LBM és el longitud total de la membrana basal capil·lar perifèrica (BM).

Anàlisi estadística

Les dades s'expressen com a mitjana ± error estàndard de mesura i s'analitzen mitjançant SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, EUA) i GraphPad Prism 6 per a Windows (GraphPad Software Inc., EUA). La distribució normal es va avaluar mitjançant diagrames qq i la prova SW. Les dades mostraven una distribució normal. Quan es van comparar dos grups de dades, es va aplicar la prova t de mostres independents. Es van comparar les diferències entre tres o més grups independents mitjançant una anàlisi de variància unidireccional seguida de la prova post hoc de Tukey. La significació estadística es va establir a la p<>

Resultats

Selecció de concentracions òptimes i citotoxicitat de tetrandrina, CsA i U73122

Es va utilitzar l'assaig CCK{{0}} per detectar la viabilitat cel·lular. Com es mostra a les figures 1a i b, la concentració màxima d'10μmol/L de tetrandrina i 0.1μmol/L de CsA no va afectar la viabilitat dels podòcits MPC5. L'assaig d'alliberament de LDH va confirmar a més que 10 μmol/L de tetrandrina i 0, 1 μmol/L de CsA durant 48 h no van mostrar cap toxicitat, mentre que 10 μmol/LU73122 durant 10 minuts van mostrar la toxicitat esperada (Fig. 1c). Per tant, els experiments cel·lulars posteriors van utilitzar tetrandrina i CsA a 10 μmol / L i 0, 1 μmol / L, respectivament.

La tetrandrina va disminuir el Ca2 intracel·lular més infux a les cèl·lules MPC5 cultivades que sobreexpressen TRPC6

Mitjançant la transfecció de plasmidis, es va establir amb èxit un model cel·lular de sobreexpressió TRPC6 en podòcits MPC5. L'anàlisi qRT-PCR i Western blot van demostrar que els nivells d'expressió de TRPC6 al grup Over-TRP van augmentar significativament en comparació amb els dels grups NC i Lv-NC (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

La imatge de fluorescència (Fig. 2c) i l'anàlisi semicuantitativa (Fig. 2d) van indicar que la sobreexpressió de TRPC6 millorava el Ca2 intracel·lular més l'afluència, mentre que no hi havia diferències òbvies entre els grups NC i Lv-NC. A continuació, es van tractar deu cèl·lules del grup OverTRP amb els fàrmacs experimentals. Els grups de pretractament de fàrmacs (tetrandrina, CsA i U73122) van tenir efectes inhibidors sobre el Ca2 intracel·lular més l'afluència (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Efectes de la tetrandrina sobre l'activitat i l'expressió de calpain-1, calcineurina, Talin-1 i nefrina a les cèl·lules MPC5

S'ha demostrat que el Ca2 plus intracel·lular activa la calpaina, una proteasa de cisteïna depenent de Ca2 plus, i la calcineurina, una proteïna fosfatasa depenent de Ca2 plus/calmodulina. D'acord amb les observacions anteriors, els nivells d'activitat i expressió de calpaina i calcineurina al grup Over TRP van ser tots més alts que els dels grups NC i Lv-NC (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) i nefrina (pàg<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Fig. 3f, g, j i k).

Els gels i taques de longitud completa es van incloure a la figura complementària S1.

Experiments in vivo utilitzant un model d'ADRN de rata Per caracteritzar la resposta a la inhibició de la senyalització de TRPC6/calpain-1 mediada per tetrandrina in vivo, es va desenvolupar un model d'ADRN en rates. Els perfils d'expressió d'ARNm i proteïnes de TRPC6 van augmentar significativament al grup ADRN en comparació amb els de les rates alimentades amb menjar normal (grup NC; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

El tractament amb CsA no va bloquejar l'activació de la calpaïna induïda per la sobreexpressió de TRPC6 (Fig. 4c) i l'efecte no va ser tan robust com el de la tetrandrina sobre l'expressió de la proteïna cal pain-1 (p.<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

El tractament amb CsA no va bloquejar l'activació de la calpaïna induïda per la sobreexpressió de TRPC6 (Fig. 4c) i l'efecte no va ser tan robust com el de la tetrandrina sobre l'expressió de la proteïna calpaina-1 (p.<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

A més, es va avaluar l'expressió de Talin-1 i nefrina (Fig. 4h, i, l i m). Tant els nivells de Talin-1 com de nefrina es van reduir a les rates ADRN en comparació amb els del grup NC (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Els gels i taques de longitud completa es van incloure a la figura complementària S2.

La tetrandrina va suprimir la progressió de l'ADRN i va rescatar l'efecte histopatologia de la tetrandrinaronyóPosteriorment es va avaluar la funció en rates Sprague-Dawley tractades amb ADRN (Fig. 5a-d). No hi va haver diferències significatives inicials en els nivells de proteinúria de 24-h, Scr i BUN entre els grups. Dotze setmanes més tard, els nivells de proteïnúria de 24 hores, Scr i BUN en el grup ADRN van augmentar estadísticament, mentre que el de l'albúmina plasmàtica es va reduir notablement, en comparació amb els del grup NC (P).<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; dades no mostrades).

Els canvis en la histomorfologia es mostren a la figura 6. En rates ADRN, la tinció de H&E i Masson va mostrar FSGS, fibrosi tubulointersticial i infiltració de cèl·lules inflamatòries intersticials renals. A més, les imatges de microscòpia electrònica dels glomèruls van revelar processos de peu de podòcits molt esborrats, engreixats i fusionats amb un 80-100% de PFR de podòcits. Les rates dels subgrups de tetrandrines (grups de dosis mitja i alta) van presentar menys lesions que el grup d'ADR amb diferents graus, i la millora en el grup de dosis altes va superar la del grup de dosis mitjana. En els grups tractats amb tetrandrina de dosis baixa, mitjana i alta, els PFR dels podòcits eren del 70-80%, 50-60% i 30-40%, respectivament. Aquestes dades suggereixen que la tetrandrina va protegir contra el dany estructural dels glomèruls renals induït per l'administració d'ADR. No hi va haver diferències significatives en els canvis patològics sota un microscopi de llum entre els grups (tetrandrina d'alta dosi, CsA i tetrandrina en combinació amb CsA). A més, el PFR del podòcit del grup ADRN tractat amb CsA era el mateix que el dels grups tractats amb tetrandrina a dosis altes.

Discussió

Els podòcits s'han tornat cada cop més crucials com a objectiu per a les intervencions en FSGS i malalties nefròtiques relacionades [20, 21]. Aquí, a partir de dades in vitro i in vivo, ho va ser

va demostrar que la protecció dels podòcits i l'efecte antiproteinúric de la tetrandrina, un bloquejador de canals de Ca2 més no selectiu, estava mediat per la inhibició de l'afluència intracel·lular de Ca2 més i la cascada de senyalització de la calpaïna-1 depenent de Ca2 més, inclosa la Talina-1 , nefrina i calcineurina. La tetrandrina va ser més eficaç que en impedir la inhibició de la calpaïna-1.

Segons troballes anteriors, el podòcit TRPC6 és el canal que contribueix principalment als canvis en el Ca2 més l'afluència en condicions normals i patològiques [7, 22]. És àmpliament conegut que l'activitat de la calpaïna depèn dels nivells de calci i s'associa ambronyólesió, particularment lesió renal antiglomerular BM [10, 23]. Entre les 15 isoformes de calpaïna identificades, recentment s'ha demostrat que la calpaina-1 vincula l'activitat de TRPC6 amb la lesió dels podòcits [24]. S'ha informat que calpain-1 escinda la proteïna d'ancoratge associada al citoesquelet del podòcit Talin-1 i la proteïna del diafragma escletxat, la nefrina, que pertorba la integritat del podòcit i indueix una proteinúria severa [8–12, 16]. La calcineurina és una fosfatasa depenent de Ca2 plus que s'ha demostrat anteriorment que té un paper en podòcits ironyófunció. L'evidència acumulada indica cada cop més que la calpaina pot escindir i activar la calcineurina d'una manera proteolítica [25, 26]. Aquest estudi va crear models de sobreexpressió TRPC6 per infecció per virus en podòcits cultivats i injecció d'adriamicina en rates SD. D'acord, vam demostrar que el TRPC6-mediat el Ca2 més l'afluència activava l'activitat de la calpaïna i l'expressió de la calpaïna-1 del membre de la família de la calpaïna. L'augment de la calpain-1 va escindir posteriorment la Talin-1 i la nefrina aigües avall.

La tetrandrina és un alcaloide extret d'una planta de medicina tradicional de la Xina i és un bloquejador de canals de Ca2 més no selectiu. Aquí, es va reafirmar que la tetrandrina va inhibir la sobreexpressió de TRPC6 i va reduir l'afluència de Ca2 plus tant a les cèl·lules com a les rates que sobreexpressaven TRPC6, tal com es va documentar anteriorment [16]. Més important encara, aquest estudi se centra en l'efecte intervingut de la tetrandrina en la via de senyalització aigües avall depenent del calci. Es va observar que, a diferència de la CsA, la tetrandrina va reduir l'activitat de la proteasa neutral activada per calci (calpaina). A més, la tetrandrina va disminuir l'expressió de la família de proteases activades per calci, la calpaina-1, i va restaurar l'expressió regulada a la baixa de la talina-1 i la nefrina. En comparació amb CsA, l'administració de tetrandrina va mostrar efectes superiors sobre la inactivació de la calpaïna i l'expressió baixada de la calpaina-1. Aquests resultats van mostrar que la tetrandrina té un potencial terapèutic en el dany dels podòcits en bloquejar l'activació depenent de TRPC6-de la via de senyalització de la calpaïna-1.

S'ha identificat que la fosfolipasa C (PLC) és un soci d'unió de TRPC6-[27]. U73122 inhibeix el PLC de manera que es genera menys diacilglicerol i es redueix l'obertura del canal TRPC6 [18, 24]. Per tant, l'U73122 es va utilitzar en paral·lel com a control positiu i va mostrar un efecte notable en la reducció de l'afluència intracel·lular de Ca2 més, la inhibició de l'activitat de la calpaïna i l'expressió de calpain-1 en podòcits que sobreexpressen TRPC6. Tanmateix, els assajos de citotoxicitat in vitro van mostrar una toxicitat aparent per als podòcits.

En aquest estudi, després de 12 setmanes d'injecció d'ADR, es va evidenciar una proteinúria greu, hipoalbuminèmia i nivells elevats de BUN i Scr en rates tractades amb ADR--. La microscòpia de llum va revelar FSGS, fibrosi tubulointersticial i infiltració de cèl·lules inflamatòries intersticials renals a les rates ADRN. La microscòpia electrònica va demostrar un esborrament generalitzat dels processos del peu. Les dades in vivo van demostrar a més que la teràpia amb tetrandrina pot reduir la proteinúria, millorar la funció renal i atenuar la progressió de la glomeruloesclerosi. Després del tractament amb tetrandrina, els canvis patològics sota el microscopi lleuger i el microscopi electrònic, la proteinúria 24-h, l'albúmina plasmàtica, Scr i BUN en rates ADRN es van millorar significativament en comparació amb les del grup NC.

L'inhibidor de la calcineurina, CsA, s'ha utilitzat durant molt de temps per tractar la proteinuriaronyómalalties [28]. La calcineurina és clínicament important com a objectiu directe del fàrmac immunosupressor CsA [17, 29]. CSA redueix l'expressió de calcineurina i disminueix el factor nuclear mediat per calcineurina de les cèl·lules T activades [30–32]. Les evidències recents donen suport a l'efecte estabilitzador de CsA sobre el citoesquelet d'actina del podòcit, com ara la sinaptopodina bloquejant la desfosforilació de la sinaptopodina mediada per calcineurina [17]. També s'ha demostrat que la calpaina pot escindir i activar la calcineurina d'una manera proteolítica [25, 26]. Les dades d'aquest estudi van reafirmar que la CsA va inhibir l'activitat i l'expressió de la calcineurina amb més força que la tetrandrina. Com s'ha informat anteriorment, la CsA no sembla afectar directament l'activitat de la calpaïna.

Una limitació important de l'estudi va ser la manca de demostrar un efecte dependent de la dosi entre els subgrups de tetrandrines (grups de dosis baixes, mitjanes i altes). Una possible explicació podria ser que el rang de dosis que vam utilitzar era massa alt per a les rates. A més, les diferències individuals en l'experiment amb animals poden ser considerablement més grans que les diferències de dosi. La mida relativament petita de la mostra pot reduir el poder estadístic. Per tant, es necessiten estudis addicionals que incloguin dosis considerablement més petites i una mida de mostra adequada per determinar l'interval de dosi exacte i l'efecte de la tetrandrina en rates ARDN.

En resum, en la regulació de les vies de senyalització del calci, la tetrandrina va mostrar un efecte inhibidor evident sobre la calpaina-1, mentre que la CsA va influir directament en la inhibició de la calcineurina. Aquestes troballes suggereixen que el tractament combinat de tetrandrina i CsA pot afectar múltiples objectius de la xarxa de senyalització de calci per millorar els resultats clínics. Calen estudis de confirmació per validar aquestes observacions així com per dilucidar els mecanismes dels efectes sinèrgics.

Abreviatures

FSGS: Esclerosi glomerular segmentària focal; MCD: malaltia de canvi mínim; MN: Nefropatia membranosa; DKD: diabèticronyómalaltia; TRPC6: proteïna 6 del canal catiònic potencial del receptor transitori; Ca2 més: Calci; MTC: Medicina tradicional xinesa clàssica; Tet: Tetrandrina; CsA: ciclosporina A; Scr: creatinina sèrica; BUN: Nitrogen d'orina en sang; PFR: velocitat de fusió dels processos; BM: Membrana basal; ADRN: nefropatia induïda per adriamicina; PLC: fosfolipasa C.

Referirnces

1. Garg P. Una revisió de la biologia dels podòcits. Sóc J Nephrol. 2018;47(Suppl 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK, et al. Teràpies basades en cèl·lules mare mesenquimals contra el dany dels podòcits en la nefropatia diabètica. Tissue Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Lesió dels podòcits i les seves conseqüències. Ronyó Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Biologia cel·lular del podòcit glomerular. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, et al. La mutació de pèrdua de funció TRPC6 G757D s'associa amb FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, et al. Una via NOX4/TRPC6 en la regulació del calci dels podòcits i el dany renal en la malaltia renal diabètica. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, et al. TRPC6 és un canal associat al diafragma d'escletxa glomerular necessari per a la funció renal normal. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X, et al. La inhibició de la via del senyal TRPC6 alleuja la lesió dels podòcits induïda pel TGF- 1. Cell Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. La proteasa dependent del calci Calpain-1 enllaça l'activitat de TRPC6 amb la lesió dels podòcits. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. L'activació i la secreció de calpaina promouen la lesió glomerular en la glomerulonefritis experimental: evidència de ratolins transgènics de calpastatina. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. La talin1 associada als podòcits és fonamental per al manteniment de la barrera de filtració glomerular. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H, et al. La sobreexpressió del canal catiònic potencial del receptor transitori 6 als podòcits indueix la reordenació del citoesquelet mitjançant augments de l'activació intracel·lular de Ca2 plus i RhoA. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC, et al. Detecció de possibles components actius de Fangji Huangqi tang en el tractament de la síndrome nefròtica mitjançant l'ús de metabolòmica integrada basada en "correlacions entre perfils químics i metabòlics". Front Pharmacol. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT, et al. La tetrandrina indueix l'apoptosi a les cèl·lules del carcinoma nasofarínge humà NPC-TW 039 mitjançant l'estrès del reticle endoplasmàtic i les vies de Ca2 més /Calpain. Res. anticancerígena 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W, et al. Projecte optimitzat de la medicina tradicional xinesa en el tractament de la malaltia renal crònica etapa 3: un assaig controlat aleatori, doble cec, multicèntric. J Etnofarmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, et al. La tetrandrina suprimeix el dany dels podòcits induït per la sobreexpressió de la proteïna del canal catiònic potencial del receptor transitori mitjançant el bloqueig de la senyalització RhoA/ROCK1. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.