L'eficàcia i la seguretat de la pinocembrina en un model d'ovella de fibrosi pulmonar induïda per bleomicina

Contacte:tina.xiang@wecistanche.com

Resum

La primàriaflavonoide, la pinocembrina, es creu que té una varietat d'usos mèdics relacionats amb el seu antioxidant informat,antiinflamatori, propietats antimicrobianes i anticancerígenes. Alguns estudis han informat que aquest flavonoide té activitats antifibròtiques. En aquest estudi, vam investigar si la pinocembrina impediria la fibrosi, esmorteïria la inflamació i millorariapulmófuncionen en un model animal gran de fibrosi pulmonar. La fibrosi es va induir en dos segments pulmonars localitzats en cadascuna de les 10 ovelles participants a l'estudi. Això es va aconseguir mitjançant dues infusions de bleomicina administrades broncoscòpicament a un interval de dues setmanes. Un altre segment de pulmó de la mateixa ovella es va deixar sense tractar i es va utilitzar com a control sa. Els animals es van mantenir una mica més de 5 setmanes després de la infusió final de bleomicina. La pino-cembrina, aïllada de fulles d'eucaliptus, es va administrar a un dels dos segments pulmonars danyats per bleomicina a una dosi de 7 mg. Aquesta dosi es va administrar una vegada a la setmana durant 4-setmanes, començant una setmana després de la infusió final de bleomicina. El compliment pulmonar (com a mesura de rigidesa) es va millorar significativament després de quatre administracions setmanals de pinocembrina a segments pulmonars danyats per bleomicina. Hi va haver un nombre significativament menor de neutròfils i cèl·lules inflamatòries al rentat broncoalveolar dels segments pulmonars infusionats amb bleomicina que es van tractar amb pinocembrina. En comparació amb els segments pulmonars danyats per la bleomicina sense tractament farmacològic, l'administració de pinocembrina es va associar amb un nombre significativament menor de cèl·lules CD8t i CD4 més T immunopositives al parènquima pulmonar. Les dades de puntuació histopatologia van mostrar que el tractament amb pinocembrina es va associar amb una millora significativa de la inflamació i les puntuacions generals de la patologia. L'anàlisi d'hidroxiprolina va demostrar que l'administració de pinocembrina no va reduir l'augment del contingut de col·lagen induït per la bleomicina en aquest model. Les anàlisis de les seccions tenyides de Tricrom de Masson van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir significativament el contingut de teixit connectiu en els segments pulmonars exposats a la bleomicina en comparació amb els pulmons infusionats amb bleomicina que no van rebre pinocembrina. Els sorprenents efectes de remodelació antiinflamatoris i antifibròtics modestos de l'administració de pinocembrina probablement estaven relacionats amb la capacitat del compost per millorar la patologia pulmonar i el compliment funcional en aquest model animal de fibrosi pulmonar.

Feu clic per obtenir més informació

Introducció

La primàriaflavonoide, pinocembrina, s'ha identificat i aïllat d'una sèrie d'espècies vegetals. Es creu que aquesta molècula bioactiva té una varietat d'usos mèdics relacionats amb el seu antioxidant.antiinflamatori, propietats antimicrobianes i anticancerígenes [1-7]. És important destacar que s'ha demostrat que la pinocembrina té propietats antifibròtiques en diversos models animals de malaltia. Per exemple, la pinocembrina redueix la fibrosi ventricular [8] en un model de depressió de rata i redueix la fibrosi auricular en un model de rata d'infart de miocardi [9]. De la mateixa manera, en un model experimental de rata de fibrosi hepàtica induïda per cloroform, l'administració oral de pinocembrina va reduir l'expressió de col·lagen i alfa-SMA (utilitzat com a marcador de diferenciació de miofibroblast), com a mesures de fibrosi [10]. Un estudi recent ho demostra

La pinocembrina alleuja la fibrosi cutània induïda per la bleomicina en ratolins i suprimeix la proliferació, la migració i la invasió de fibroblasts queloides i fibroblasts dèrmics primaris de ratolí in vitro [11]. La pinocembrina va induir aquests efectes antifibròtics mitjançant la regulació a la baixa de les vies de senyalització NF-x i TGF - 1/Smad [10, 11].

Tenint en compte els efectes antifibròtics coneguts de la pinocembrina, vam voler determinar si la pinocembrina impediria la fibrosi i milloraria.funció pulmonaren un gran model animal de fibrosi pulmonar. El model rellevant fisiològicament i farmacològicament per a la fibrosi pulmonar es va desenvolupar com a vehicle per investigar els mecanismes subjacents de la malaltia per a la fibrosi pulmonar idiopàtica (IPF) de la condició humana [12,13]. També ha estat útil per provar nous tractaments contra la fibrosi pulmonar [14-16].

La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és una malaltia pulmonar crònica devastadora caracteritzada per una cicatrització pulmonar progressiva a causa de l'acumulació exuberant de matriu extracel·lular (ECM) al parènquima pulmonar [17]. El pronòstic de la FPI és molt dolent amb només 3-5 anys de supervivència mitjana dels pacients després del diagnòstic [18]. Els tractaments farmacològics disponibles actuals es limiten a la pirfenidona i el nintedanib, fàrmacs que s'ha demostrat que només frenen la progressió de la malaltia, sense aturar-la. A més, hi ha efectes secundaris adversos significatius associats amb aquests dos fàrmacs. Per tant, hi ha una necessitat insatisfeta de nous tractaments efectius per a aquesta malaltia.

L'objectiu d'aquest estudi va ser avaluar l'eficàcia terapèutica i la seguretat de la pinocembrina en un model d'ovella de fibrosi pulmonar induïda per bleomicina desenvolupat al nostre laboratori(12). Concretament, es va realitzar un estudi per determinar si l'administració pulmonar local de pinocembrina va atenuar significativament la fibrosi, la inflamació i la histopatologia en segments pulmonars específics després de la inducció de fibrosi amb bleomicina. És important destacar que es va determinar si l'administració local de pinocembrina va millorar significativament la funció fisiològica de segments pulmonars específics amb fibrosi induïda per bleomicina.

Materials i mètodes

Inducció de fibrosi en segments pulmonars d'ovella

En aquest estudi, hem utilitzat un total de 10 ovelles. Vam induir fibrosi en dos segments pulmonars de cada ovella d'una manera similar als nostres estudis anteriors [12, 13]. Mitjançant aquest procediment establert (vegeu els detalls a continuació), la fibrosi es va limitar a regions petites i aïllades dels pulmons, deixant el 90-95 percentatge restant dels pulmons sans afectats per dur a terme la funció respiratòria normal.

Totes les ovelles de l'estudi van ser desafiades amb 2 dosis individuals de bleomicina (3 unitats) per segment de pulmó, amb 2 setmanes de diferència i els animals es van mantenir durant una mica més de 5 setmanes després de la dosi final de bleomicina. El procediment d'administració va implicar la inserció d'un broncoscopi als segments pulmonars. al pulmó dret i esquerre, i després infusionant lentament a través del port de biòpsia del broncoscopi, la bleomicina en dos segments, tal com es mostra a la figura 1.

El moment de les infusions de bleomicina, el mostreig de sang, el mostreig de rentat broncoalveolar i les proves de funció pulmonar i l'aplicació de pinocembrina es detallen a Eig2. Tots els procediments experimentals amb animals van ser aprovats pel comitè d'ètica animal de la Universitat de Melbourne (número d'identificació d'aprovació d'ètica animal: 2015209.1). Aquests procediments experimentals i terminis associats al treball amb animals van ser dissenyats per alleujar i minimitzar el patiment de les ovelles utilitzades en l'estudi. En particular, el nombre de procediments broncoscòpics es va reduir al mínim que permetria una interpretació correcta de les dades.

Aïllament i confirmació estructural de la pinocembrina

La pinocembrina es va purificar a partir d'extractes de metanol de fulles recollides d'Eucalyptus pressiana subsp. es van cultivar plantilles de pressiana en una parcel·la experimental al campus Dookie de la Universitat de Melbourne (36 graus 23'3"S, 145 graus 42'52"E). Les llavors comprades a Nindethana Seed Company (King River, Austràlia) s'havien recollit a Woodenellup, Austràlia Occidental, i les plàntules es van criar i trasplantar a la parcel·la tal com es descriu a [19]. Les fulles mostrejades es van assecar en un forn a 5{{40}} graus durant 48 h abans de ser triturades fins a obtenir una pols fina amb un molí IKA MF10 equipat amb una malla de l mm. El teixit mòlt (100 g) es va col·locar en didals de cel·lulosa Kinesis XK (Antylia Scientific, Chicago, EUA) i es va sotmetre a extracció Soxhlet amb MeOH al 100% (200 ml) durant 8 h. Els extractes de MeOH es van concentrar fins a aproximadament 50 ml mitjançant evaporació rotativa. Les alíquotes d'extractes concentrats (2 ml) es van sotmetre a cromatografia flash en un sistema Revelers X2 (Buchi AG, Flawil, Suïssa) equipat amb un cartutx FlashPure C18 RP-WP 12g (Buchi). El sistema de dissolvent utilitzat va ser un gradient d'acetonitril (MeCN) i aigua de 30-100 per cent de MeCN durant 5 min amb un temps d'equilibri d'1 min (S1 Fig). La fracció que conté pinocembrina es va detectar a 283 nm i es va recollir. Es van agrupar les fraccions de múltiples execucions de Flash, es va eliminar el MeCN mitjançant evaporació rotativa i la pinocembrina es va assecar mitjançant la liofilització. L'estructura de la pinocembrina es va confirmar mitjançant espectroscòpia ESI-LCMS i RMN tal com es descriu a [19] en comparació amb un estàndard comercial (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Pinocembrina: cristalls groc pàl·lid de MeCN/H, O.UVλmax MeCN（nm）∶ banda-I325 nm, banda-II289 nm. 'H RMN（600 MHz, CDCl）∶δ5,36（1H,dd,J13,0,3,0 Hz,H-2）,δ2,76（1H,dd,J17,1,3,1Hz,H{ {51}}a）,δ3,02（1H,dd,J17,1,13,1 Hz,H-3b）,δ5,92（1H,d,2,2Hz,H-6), δ5,94 (1H,d,2,2Hz,H-8) ([M{-42-H],19), 151,0037([M{{-104-H],16),257,0811([M{-42-H],100),153,0167([M{-104 més H], 2). La puresa basada en massa de la pinocembrina aïllada es va quantificar en un mínim del 96 per cent mitjançant HPLC-PDA en comparació amb un estàndard comercial (Fig S2A i S2B).

Administració de pinocembrina a segments pulmonars d'ovella

Per a cada setmana del règim de dosificació, es van infondre 7 mg de pinocembrina en un únic segment de pulmó caudal a cada ovella sotmesa a la prova (Fig 1). Aquesta dosi de pes de pinocembrina es va basar en un estudi publicat anteriorment que va demostrar que 50 mg de pinocembrina per kg de pes corporal era la dosi més eficaç per millorar els símptomes de la malaltia en aquest model animal [20]. La dosi de 7 mg de pinocembrina va permetre el fet que només aproximadament 150 g de segment pulmonar per ovella es van tractar a ~ 50 mg/kg. El bioactiu es va dissoldre en un 10 per cent de DMSO i es va administrar una vegada a la setmana durant un període de quatre setmanes, tal com es mostra a la figura 2. Amb finalitats de control, el segment pulmonar del pulmó oposat es va utilitzar com a control positiu per a la bleomicina, sense fàrmacs. , tal com s'indica a la figura 1. Les molècules bioactives del vehicle es van lliurar com a infusions de 5 ml a través del port de biòpsia del broncoscopi. Tingueu en compte que per anul·lar les petites diferències (per exemple, fisiològiques o anatòmiques, etc.) entre els pulmons esquerre i dret, les infusions de pinocembrina es van aleatoritzar entre els segments de pulmó caudal esquerre i dret. La meitat dels animals (n=5 ovelles) van rebre pinocembrina als segments del pulmó caudal dret, mentre que les altres (n{=5 ovelles) van rebre pinocembrina als segments del pulmó caudal esquerre. El segment del pulmó medial dret no es va tractar i es va utilitzar per a un teixit de control pulmonar sa que es va mostrar a l'autòpsia (Fig 1).

Procediments de mostreig de rentat broncoalveolar

Per a cadascuna de les mostres broncoalveolars (BAL) en els punts de temps enumerats a la figura 2, l'endoscopi es va manipular en un segment de pulmó específic per al mostreig, normalment passant per unes 3 o 4 branques de les vies respiratòries. Per al mostreig de BAL, es van infondre 10 ml de solució salina estèril a través del port de biòpsia de l'endoscopi al segment de pulmó específic i després es van recuperar en una xeringa pel mateix port. Aquest procediment va recuperar entre 3 i 5 ml de líquid BAL. El mètode de mostreig va recollir cèl·lules per a anàlisis de les vies aèries petites i dels llums alveolars del segment de pulmó específic on es va navegar el broncoscopi. Les cèl·lules BAL de cada segment es van centrifugar sobre portaobjectes de vidre i es van tacar per al recompte diferencial de cèl·lules inflamatòries amb Hem-Quik, tal com es va descriure anteriorment [13].

Anàlisis i proves de la funció pulmonar

La funció pulmonar es va mesurar als segments pulmonars descrits en els moments indicats a la figura 2. La funció pulmonar es va avaluar en tots els segments pulmonars de prova (lòbuls caudals esquerre i dret i lòbul medial de cada ovella). La capacitat funcional dels segments pulmonars es va mesurar mitjançant l'endoscopi mitjançant un procediment publicat [12,13]. El paràmetre de funció pulmonar avaluat en aquest estudi es va denominar compliance en el segment pulmonar (abreujat a Cseg). En general, el compliment és una mesura de la facilitat que és inflar el pulmó. Un pulmó poc compatible es coneix com a pulmó rígid, que normalment és més difícil d'inflar.

Presa de mostres de sang

Es va recollir sang sencera a la línia de base abans de la inducció de la fibrosi i al final de l'experiment abans de l'eutanàsia d'animals d'experimentació, tal com s'indica a la figura 2, extreuant sang de la vena jugular a un tub que contenia heparina. La sang es va processar per analitzar el recompte de cèl·lules sanguínies.

Aïllament i anàlisis de teixit pulmonar

Les ovelles van ser sacrificades una mica més de 5 setmanes després de l'última dosi de bleomicina (inicis de la setmana 12), tal com s'indica a la figura 2. L'eutanàsia es va induir mitjançant una sobredosi de barbitúrics administrada IV a ml per 2 Kg de pes corporal tal com recomana el fabricant (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd. Després de l'eutanàsia, es van eliminar els pulmons i es van identificar i disseccionar acuradament els segments pulmonars dirigits lliures dels voltants). A continuació, es van inflar els segments individuals amb una barreja 1:1 de OCT (Temperatura de tall òptima, Tissue-Tek) i solució de PBS estèril, sota la pressió d'aproximadament 20 cm/H, O[13]. Diverses seccions transversals en sèrie del teixit. El segment inflat es va fixar en formalina tamponada neutra al 10% i es van processar en parafina per a l'avaluació histopatològica.Les rodanxes de pulmó restants es van incrustar a OCT i es van congelar en crio-motlles en vaixells d'alumini que flotaven sobre nitrogen líquid.

Les seccions de teixit incrustat en parafina (5 μm) es van tenyir amb hematoxilina i eosina Y (H&E) per a la histologia general i amb la tinció de tricrom de Masson per identificar els canvis en el contingut de col·lagen dins del parènquima pulmonar.

Immunohistoquímica

La localització immunohistoquímica de limfòcits T CD4 * i CD8 es va realitzar en seccions congelades. Les seccions de teixit pulmonar (5 μm) es van fixar amb etanol gelat; Els peròxids endògens es van bloquejar amb H, O, solució i les seccions es van incubar amb anticossos primaris (ratolí monoclonal anti CD4 (net) i ratolí monoclonal anti CD8 (net)) en una cambra humida durant 2 hores a temperatura ambient. Després de la incubació amb anticossos primaris,

A continuació, es van rentar les seccions amb PBS tres vegades i es van incubar amb anticossos secundaris (IgG antiratolí de conill (HRP) (ab6728)) (1:100; Abcam, Melbourne, Austràlia) durant 1 hora a temperatura ambient. Per comprovar l'especificitat, es van incloure controls d'isotip durant l'IHCrun mitjançant un anticòs SBU-3 biològicament irrellevant del mateix isotip. Les seccions es van tacar amb la solució d'hematoxilina de Mayer durant 20 segons. El complex antigen-anticossos es va visualitzar amb 3,3'-diaminobenzidina. Finalment, es van deshidratar les seccions mitjançant etanol, es van netejar en xile i es van muntar en DPX.

Puntuació histopatologia

La histopatologia del parènquima pulmonar es va avaluar mitjançant un sistema de puntuació semicuantitatiu tal com es va descriure anteriorment[12,13]. Breument, totes les diapositives histològiques estaven cegades perquè l'avaluador no conegués els grups de tractament. Per a cada secció tenyida de H&E, es van classificar 10 camps consecutius i no superposats amb un augment de x200 segons els criteris de puntuació de la fibrosi, la inflamació i les puntuacions generals de patologia tal com es va informar anteriorment [12,13]. Les àrees es van seleccionar lluny de les grans vies respiratòries i dels grans vasos sanguinis. A continuació, es van promediar les puntuacions dels deu camps per donar puntuacions representatives dels paràmetres avaluats al segment pulmonar seccionat.

L'anàlisi de la concentració de proteïnes de col·lagen mitjançant l'assaig d'hidroxiprolina es va utilitzar per extrapolar el contingut i la concentració de col·lagen de cada segment, tal com es va descriure anteriorment (4,5). Breument, els teixits pulmonars congelats de cada segment es van liofilitzar a pes sec, es van hidrolitzar en HCl 6M i es van avaluar el contingut d'hidroxiprolina mesurant l'absorbància de mostres reconstituïdes (en 0.1M HCl) a 558 nm amb un Beckman. Espectrofotòmetre DU-64 (Beckman Coulter Inc, Brea, CA). El contingut d'hidroxiprolina es va determinar a partir d'una corba estàndard de trans-L-hidroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich). El contingut de col·lagen es va extrapolar multiplicant les mesures d'hidroxiprolina per 6,94 (basat en la hidroxiprolina que representa ~ 14,4 per cent de la composició d'aminoàcids del col·lagen a la majoria dels teixits [21]) i després es va expressar com a proporció del teixit de pes sec per obtenir la concentració de col·lagen (que s'expressava com a percentatge).

L'anàlisi del contingut del teixit connectiu per avaluar el grau de fibrosi es va quantificar mitjançant l'avaluació dels canvis en el contingut global del teixit connectiu dins del teixit parenquimàtic mitjançant un mètode descrit anteriorment [13]. Per realitzar aquesta anàlisi, es van tenyir seccions de parafina de teixits pulmonars d'ovella mitjançant una taca tricroma de Masson que tenyeix el teixit connectiu de blau. Posteriorment, es van capturar imatges de la secció de pulmó tenyida de tricrom de Masson mitjançant una càmera digital connectada a un microscopi i un ordinador. Es van capturar deu camps aleatòriament amb un augment de x400, excloent els grans vasos sanguinis i els bronquis. A continuació, es van analitzar les imatges mitjançant Image-Pro Plus (versió 6.3 per a Windows, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, EUA) mitjançant l'eina de selecció de color per mesurar l'àrea de teixits tacats de blau (col·lagen i altres teixits connectius) dins de cada camp. de vista. Els valors de cadascuna de les deu imatges es van fer la mitjana per a cada diapositiva. La fracció de l'àrea de teixit tacat de blau es va expressar com a percentatge per àrea total de camp (percentatge d'àrea de teixit tacat de blau per àrea total de camp). La captura i l'anàlisi d'imatges es van realitzar de manera cega en diapositives codificades.

Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant GraphPad Prism per a Windows versió 5.01 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA, Estats Units). Es van avaluar els paràmetres per a gaussians

distribució mitjançant la normalitat de D'Agostino i la prova òmnibus de Pearson. Per a dades paramètriques, es van realitzar proves t de dues cues aparellades per comparar entre els segments pulmonars rebuts de bleomicina només amb els segments de control infusionats amb solució salina i els segments pulmonars rebuts de bleomicina més infusió de pinocembrina. Per a les dades que no complien els supòsits per a la distribució gaussiana, es va utilitzar la prova de rang signat de parells coincidents de Wilcoxon. En tots els casos, un valor p inferior a 0,05 es va definir com una diferència significativa. Tots els valors es presenten com a mitjans (± SEM).

Resultats

Salut animal i seguretat de l'administració de pinocembrina

Els controls de salut es van realitzar de forma rutinària durant els períodes de tractament i la prova fins a l'eutanàsia. Això va ser per comprovar que el tractament amb pinocembrina no va causar problemes de salut nocius ni efectes secundaris adversos a les ovelles sotmeses a l'assaig. Tots els animals es van mantenir sans durant tot el període de tractament amb pinocembrina (de la setmana 8 a la setmana 12, figura 2). Durant aquest període, els animals van continuar augmentant de pes en l'interval normal esperat per a aquestes ovelles, tenien un recompte de glòbuls blancs normals i no hi va haver cap esdeveniment advers per a la salut.

L'administració de pinocembrina millora la disminució de la funció pulmonar associada al desenvolupament de fibrosi pulmonar induïda per bleomicina

La figura 3 mostra la funció pulmonar dels diferents segments pulmonars després de tractaments setmanals amb pinocembrina durant quatre setmanes. El paràmetre de funció pulmonar mesurat va ser el compliment dels segments pulmonars locals i es coneix com a compliment segmentari (Cseg). En general, nivells més baixos de compliment significa una funció més pobre en el segment pulmonar (és a dir, més difícil d'inflar i el pulmó és més rígid). Com era d'esperar, els segments pulmonars que van rebre l'agent perjudicial bleomicina sol, sense pinocembrina, tenien un compliment segmentari mitjà significativament inferior que els segments pulmonars de control saludable no tractats (Fig 3A). Els segments pulmonars, que van rebre l'agent nociu bleomicina amb l'administració de pinocembrina, tenien un compliment segmentari mitjà més alt, que no era significativament diferent dels segments de pulmó de control saludable no tractats (Fig 3A). Una altra avaluació de la funció pulmonar utilitzada va ser el canvi percentual en el compliment respecte a la línia de base (Eig 3C). Això va mesurar el canvi en el compliment des de l'inici de l'estudi (abans dels tractaments amb bleomicina i pinocembrina) fins després de la finalització del tractament final amb pinocembrina. L'avaluació va demostrar que el compliment dels segments pulmonars tractats amb pinocembrina havia millorat significativament després de les administracions setmanals de pinocembrina durant el període de tractament 4-setmana (figura 3C).

L'administració de pinocembrina redueix l'acumulació de cèl·lules inflamatòries induïdes per la bleomicina al líquid BAL

La figura 4 mostra les dades de les cèl·lules BAL després de tractaments d'infusió una vegada a la setmana amb pinocembrina durant un període de tractament de 4-setmanes. Les cèl·lules BAL es van prendre mostres de segments pulmonars durant la setmana 12 de l'assaig, dos dies abans que les ovelles fossin sacrificades. Els recomptes de cèl·lules avaluades al líquid BAL eren només neutròfils i la suma de les principals cèl·lules inflamatòries, que incloïen els neutròfils, els eosinòfils i els limfòcits. Com era d'esperar, els segments pulmonars de control sans, que no van ser tractats, tenien un nombre relativament baix de cèl·lules inflamatòries al líquid BAL (Fig 4).

En canvi, els segments pulmonars lesionats per la bleomicina, sense pinocembrina, tenien un nombre significativament elevat de neutròfils i altres cèl·lules inflamatòries al líquid BAL en comparació amb els segments de control sans (Eig 4). Els segments pulmonars que van rebre l'agent perjudicial bleomicina i van tenir tractaments amb pinocembrina, van mostrar un nombre significativament menor de neutròfils i cèl·lules inflamatòries en comparació amb el nombre de cèl·lules mostrades dels segments pulmonars, que van rebre bleomicina sola sense pinocembrina (Fig 4).

L'efecte de la pinocembrina sobre les cèl·lules T del parenquima pulmonar

La figura 5 mostra les dades de cèl·lules T després de quatre tractaments d'infusió amb pinocembrina, administrats una vegada a la setmana. Les cèl·lules T es van avaluar al parènquima dels segments pulmonars tractats de manera diferenciada, que es van prendre mostres post mortem (setmana 12). Com era d'esperar, els segments pulmonars de control sans, que no es van tractar, tenien un nombre relativament baix de cèl·lules T CD8t i CD4 * al parènquima pulmonar (Fig 5).

En canvi, els segments pulmonars lesionats per la bleomicina, sense tractament amb pinocembrina, tenien un nombre significativament més elevat de cèl·lules T CD8 i CD4 * al parènquima pulmonar en comparació amb els segments de control sans (Eig 5). Els segments pulmonars que van rebre l'agent nociu bleomicina i van tenir tractaments amb pinocembrina van mostrar un nombre significativament menor de cèl·lules CD8t i CD4 més T al parènquima pulmonar en comparació amb el nombre de cèl·lules mostrades dels segments pulmonars, que van rebre bleomicina sola sense pinocembrina (Eig 5). ).

cada paràmetre provat (Eig⑥). És important destacar que els segments pulmonars, que van rebre l'agent lesionant bleomicina i tenien tractaments amb pinocembrina, tenien puntuacions mitjanes més baixes per a cada paràmetre avaluat (Eig ⑥). El tractament amb pinocembrina va reduir significativament la inflamació i les puntuacions generals de patologia en comparació amb els segments que només van rebre infusió de bleomicina (Fig 6). Tot i que els segments pulmonars que van rebre infusió de bleomicina i pinocembrina tenien puntuacions de fibrosi més baixes en comparació amb els segments que només van rebre infusió de bleomicina, la diferència no va ser estadísticament significativa (Fig 6).

Els efectes de la pinocembrina sobre el contingut del teixit connectiu

Les observacions microscòpiques de les seccions tacades de tricrom de Masson van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir la quantitat de teixit connectiu induït per la infusió de bleomicina (Fig7A). Les dades de la figura 7B van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir significativament el percentatge de tinció blava en els segments pulmonars exposats a la bleomicina en comparació amb el pulmó infusió de bleomicina que no va rebre tractament amb pinocembrina (Fig 7B). La figura ZC mostra dades per a l'assaig d'hidroxiprolina per al contingut de col·lagen després de quatre tractaments setmanals amb pinocembrina. Les dades de la figura 7C es van recollir dels 10 animals de l'assaig i van mostrar que la infusió de bleomicina sola (sense pinocembrina) va augmentar significativament la concentració de proteïnes de col·lagen en comparació amb les mesures respectives dels segments de control pulmonar sans, que no van rebre ni bleomicina ni pinocembrina. L'administració de pinocembrina, però, no va reduir l'augment de la concentració de col·lagen induït per la bleomicina (Fig 7C).

Discussió

Aquest estudi va fer servir un model d'ovella rellevant fisiològicament i farmacològicament per a la fibrosi pulmonar [12, 13] per determinar l'eficàcia de la pinocembrina. En general, vam trobar que el tractament amb pinocembrina va ser eficaç per millorar la patologia pulmonar induïda experimentalment i no va causar efectes nocius per a la salut en les deu ovelles sotmeses a l'assaig.

cada paràmetre provat (Fig ⑥). És important destacar que els segments pulmonars, que van rebre l'agent lesionant bleomicina i tenien tractaments amb pinocembrina, tenien puntuacions mitjanes més baixes per a cada paràmetre avaluat (Eig ⑥). El tractament amb pinocembrina va reduir significativament la inflamació i les puntuacions generals de patologia en comparació amb els segments que només van rebre infusió de bleomicina (Fig 6). Tot i que els segments pulmonars que van rebre infusió de bleomicina i pinocembrina tenien puntuacions de fibrosi més baixes en comparació amb els segments que només van rebre infusió de bleomicina, la diferència no va ser estadísticament significativa (Fig 6).

Els efectes de la pinocembrina sobre el contingut del teixit connectiu

Les observacions microscòpiques de les seccions tacades de tricrom de Masson van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir la quantitat de teixit connectiu induït per la infusió de bleomicina (Fig7A). Les dades de la figura 7B van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir significativament el percentatge de tinció blava en els segments pulmonars exposats a la bleomicina en comparació amb el pulmó infusió de bleomicina que no va rebre tractament amb pinocembrina (Fig 7B). La figura ZC mostra dades per a l'assaig d'hidroxiprolina per al contingut de col·lagen després de quatre tractaments setmanals amb pinocembrina. Les dades de la figura 7C es van recollir dels 10 animals de l'assaig i van mostrar que la infusió de bleomicina sola (sense pinocembrina) va augmentar significativament la concentració de proteïnes de col·lagen en comparació amb les mesures respectives dels segments de control pulmonar sans, que no van rebre ni bleomicina ni pinocembrina. L'administració de pinocembrina, però, no va reduir l'augment de la concentració de col·lagen induït per la bleomicina (Fig 7C).

Discussió

Aquest estudi va fer servir un model d'ovella rellevant fisiològicament i farmacològicament per a la fibrosi pulmonar [12, 13] per determinar l'eficàcia de la pinocembrina. En general, vam trobar que el tractament amb pinocembrina va ser eficaç per millorar la patologia pulmonar induïda experimentalment i no va causar efectes nocius per a la salut en les deu ovelles sotmeses a l'assaig.

Els efectes de la pinocembrina en la histopatologia

Eig6 mostra les dades de puntuació histopatologia després de quatre tractaments setmanals amb pinocembrina. Els paràmetres d'histopatologia puntuats van ser la inflamació, la fibrosi i la patologia general. Com s'esperava per a un pulmó sa normal, els segments de pulmó de control que no es van tractar, tenien puntuacions baixes per a cada paràmetre de patologia avaluat (Fig 6). En canvi, els segments pulmonars lesionats per la bleomicina, sense tractament amb pinocembrina, tenien puntuacions mitjanes significativament altes per a

cada paràmetre provat (Eig⑥). És important destacar que els segments pulmonars, que van rebre l'agent lesionant bleomicina i tenien tractaments amb pinocembrina, tenien puntuacions mitjanes més baixes per a cada paràmetre avaluat (Eig ⑥). El tractament amb pinocembrina va reduir significativament la inflamació i les puntuacions generals de patologia en comparació amb els segments que només van rebre infusió de bleomicina (Fig 6). Tot i que els segments pulmonars que van rebre infusió de bleomicina i pinocembrina tenien puntuacions de fibrosi més baixes en comparació amb els segments que només van rebre infusió de bleomicina, la diferència no va ser estadísticament significativa (Fig 6).

Els efectes de la pinocembrina sobre el contingut del teixit connectiu

Les observacions microscòpiques de les seccions tacades de tricrom de Masson van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir la quantitat de teixit connectiu induït per la infusió de bleomicina (Fig7A). Les dades de la figura 7B van mostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir significativament el percentatge de tinció blava en els segments pulmonars exposats a la bleomicina en comparació amb el pulmó infusió de bleomicina que no va rebre tractament amb pinocembrina (Fig 7B). La figura ZC mostra dades per a l'assaig d'hidroxiprolina per al contingut de col·lagen després de quatre tractaments setmanals amb pinocembrina. Les dades de la figura 7C es van recollir dels 10 animals de l'assaig i van mostrar que la infusió de bleomicina sola (sense pinocembrina) va augmentar significativament la concentració de proteïnes de col·lagen en comparació amb les mesures respectives dels segments de control pulmonar sans, que no van rebre ni bleomicina ni pinocembrina. L'administració de pinocembrina, però, no va reduir l'augment de la concentració de col·lagen induït per la bleomicina (Fig 7C).

L'eficàcia de la pinocembrina per millorar diversos paràmetres de la malaltia en un model d'ovella de malaltia pulmonar experimental

En l'estudi actual, hem trobat que la pinocembrina va ser capaç de millorar diversos paràmetres de la malaltia en el model d'ovella de fibrosi pulmonar. Els nostres principals resultats van ser que l'administració de pinocembrina va ser capaç de millorar la funció pulmonar, atenuar la inflamació pulmonar i disminuir les puntuacions generals de la patologia, que van ser induïdes per la lesió de bleomicina. És important destacar que les anàlisis estadístiques de les dades van revelar que aquestes lectures de la malaltia es van millorar significativament en els segments pulmonars tractats amb pinocembrina en comparació amb les dades corresponents dels segments pulmonars ferits i no tractats amb bleomicina.

En el model d'ovella de fibrosi pulmonar induïda per bleomicina, la lesió per bleomicina provoca pèrdua de compliment pulmonar localitzat (una mesura de rigidesa pulmonar) en segments pulmonars infusionats amb bleomicina [12-14,16,22,23].En l'estudi actual , vam trobar que el tractament amb pinocembrina va millorar significativament el compliment funcional en els segments pulmonars lesionats per la bleomicina. Això va demostrar que el tractament amb pinocembrina en segments pulmonars lesionats va donar lloc a que aquests segments funcionessin a nivells més alts que si no es tractaven.

En l'estudi actual, la identificació de cèl·lules inflamatòries de rentat pulmonar recuperades de segments pulmonars va demostrar que el tractament amb pinocembrina va reduir significativament el nombre de cèl·lules inflamatòries que ocupen els espais liminals dels alvèols i les petites vies respiratòries. El principal tipus de cèl·lules inflamatòries que es va reduir al líquid de rentat pulmonar van ser els neutròfils, que van baixar del 7,4 per cent del total de cèl·lules BAL a la bleomicina sense els segments pulmonars de tractament amb fàrmacs al 3,7 per cent en els segments pulmonars lesionats per bleomicina tractats amb pinocembrina. La reducció de les cèl·lules T CD4 i CD8 del parènquima pulmonar associada a la pinocembrina va ser totalment coherent amb la reducció de les cèl·lules inflamatòries recuperades del líquid de rentat pulmonar dels segments pulmonars exposats a pinocembrina i bleomicina. Les cèl·lules CD4 i CD8 més T són components importants en els braços cel·lulars de moltes respostes immunitàries. En general, aquestes dades donen suport a la idea que la pinocembrina tenia fortes propietats antiinflamatòries en el model de malaltia estudiat.

Pel que fa a les puntuacions histopatologia, es van millorar les puntuacions mitjanes d'inflamació i patologia general en els segments pulmonars lesionats després del tractament amb pinocembrina. És important destacar que aquestes lectures eren estadísticament inferiors als pulmons danyats tractats amb pinocembrina, en comparació amb els pulmons ferits experimentalment sense tractament amb pinocembrina. Tot i que les puntuacions mitjanes de la patologia de la fibrosi eren més baixes als pulmons danyats tractats amb pinocembrina, en comparació amb el pulmó ferit experimentalment sense tractament amb pinocembrina, aquests no van assolir significació estadística.

Com que les dades de la puntuació de la patologia de la fibrosi no eren definitives per a la pinocembrina, l'assaig d'hidroxiprolina es va realitzar en mostres de teixit dels segments pulmonars tractats de manera diferent. L'assaig d'hidroxiprolina mesura el nivell de col·lagen en una mostra de proteïnes i és una mesura de lectura estàndard d'or per quantificar els nivells de fibrosi als teixits. Aquest assaig va demostrar que la pinocembrina no va reduir la deposició de col·lagen extracel·lular associat a lesions per bleomicina. L'assaig de tricrom de Masson (una altra mesura de lectura que s'utilitza sovint per avaluar l'extensió de la fibrosi) va mostrar que el percentatge de tinció blava (és a dir, una mesura del contingut de teixit connectiu) era significativament menor en les seccions pulmonars exposades a la bleomicina i tractades amb pinocembrina en comparació amb la bleomicina exposada. seccions pulmonars que no van rebre tractaments farmacològics. En conjunt, les dades dels assaigs d'hidroxiprolina i tricrom de Masson van suggerir que la pinocembrina tenia la capacitat de reduir algunes proteïnes de la matriu extracel·lular (mostrada per les dades de tricrom de Masson), però no necessàriament col·lagen (com ho corroboren les dades d'hidroxiprolina). En general, les dades de les puntuacions de fibrosi, el tricrom de Masson i els assajos d'hidroxi-prolina van suggerir que la pinocembrina només tenia propietats antifibròtiques i anti-remodelització modestes.

S'havia demostrat anteriorment que molts compostos bioactius tenen propietats antiinflamatòries i antifibròtiques mitjançant la modulació de diversos biomarcadors profibròtics i proinflamatoris com ara TNF, TGF-endotelina-1, IFN-y, interleucines, VEGF, FGF. -2, PDGF MMP-9, TIMP, NF-kB i col·lagen-I [24]. A més, s'havia trobat que l'administració de compostos antiinflamatoris a models de ratolí infusionats amb bleomicina de fibrosi pulmonar sovint donava lloc a una reducció de la patologia fibròtica. Això va ser especialment així si les molècules antiinflamatòries es van aplicar aviat després de l'exposició a la bleomicina durant l'etapa inflamatòria (profibròtica) de la patologia en aquests models [25]. No obstant això, és important que, quan moltes d'aquestes molècules antiinflamatòries es van provar a la clínica per tractar afeccions fibròtiques, es va trobar que eren ineficaces [25]. En models animals on s'havia trobat que la pinocembrina retardava eficaçment la fibrosi induïda en altres òrgans, La pinocembrina també va inhibir les citocines proinflamatòries TNF-c, IL{19}} i IL-6 i va esmorteir les respostes inflamatòries mitjançant la depressió de la via de senyalització NF-K 9, 10. Estudis mecànics addicionals amb LPS de ratolí i bleomicina Els models van suggerir que el TLR4 (receptor similar al peatge 4) i els inflamasomes estan relacionats de manera causal amb la supressió de la pinocembrina de la senyalització inflamatòria de NF-K [2]. Igual que amb tots els models de fibrosi pulmonar induïts per bleomicina, el moment de la intervenció del fàrmac és crucial per determinar les contribucions antifibròtiques i antiinflamatòries relatives del tractament [25. El moment del tractament amb pinocembrina en l'estudi actual va ser 7 dies després de la infusió final de bleomicina, que es troba a l'inici de la fase fibròtica en aquest model[12,13]. Tot i que la inflamació era molt menor en aquest moment-7, encara era present, per la qual cosa no podem descartar que alguns dels febles efectes antifibròtics de la pinocembrina es deguessin a les seves activitats antiinflamatòries.

Anteriorment, hem utilitzat aquest model d'ovella de fibrosi pulmonar per avaluar el potencial terapèutic d'altres dos fàrmacs, els resultats dels quals poden ser útils per comparar els efectes de la pinocembrina trobats en l'estudi actual. Hem provat un inhibidor del canal iònic KCa3.1 anomenat senicapoc [15,16] i també hem investigat l'eficàcia del fàrmac pirfenidona aprovat per la FDA en el model [14]. Els dissenys d'estudi publicats eren essencialment similars a l'estudi actual de pinocembrina, amb cada estudi utilitzant 10 ovelles per grup. Els períodes de tractament amb fàrmacs van ser d'una durada similar, de quatre a cinc setmanes per a cada fàrmac. La diferència principal va ser que en els estudis de senicapoc i pirfenidona, els fàrmacs es van administrar per via oral, mentre que la pinocembrina es va administrar intrapulmonar a segments pulmonars locals. A més, tot el pulmó no va rebre pinocembrina en l'estudi actual, mentre que tot el pulmó va estar exposat a fàrmacs en els assaigs de pirfenidona i senicapoc. Les anàlisis de les dades entre aquests estudis revelen que els nivells de millora en els marcadors de malaltia del compliment pulmonar, les puntuacions generals de la patologia i la inflamació estaven a un nivell similar per a l'assaig de pinocembrina en comparació amb els altres assaigs de fàrmacs realitzats amb el model d'ovella. L'únic punt de diferència principal entre aquests estudis va ser que en els estudis publicats anteriorment, l'administració de pirfenidona o senicapoc va donar lloc a reduccions significatives de la concentració de proteïnes de col·lagen, tal com es va avaluar per l'assaig d'hidroxiprolina [14, 16] En general, la comparació entre els provats Els fàrmacs suggereixen que la millora significativa de la funció i la patologia del pulmó es produeix principalment pels efectes antiinflamatoris de la pinocembrina i, en menor mesura, per les seves accions antifibròtiques.

En l'estudi actual, es va trobar que les quatre dosis de 7 mg de pinocembrina administrades als pulmons a intervals setmanals eren ben tolerades i no tenien cap efecte secundari advers. Això és coherent amb les dades d'un assaig aleatoritzat doble cec i controlat amb placebo amb 58 pacients sans que va demostrar que la injecció intravenosa de pinocembrina era ben tolerada fins a 120 mg per dia [26]. L'assaig va avaluar els règims de dosi única i múltiple i va trobar que no hi havia problemes de seguretat importants que impedissin qualsevol desenvolupament clínic futur de l'administració de pinocembrina per injecció [26]. Les dades de l'estudi actual van demostrar que el lliurament intrapulmonar directe de pinocembrina no només era segur i viable, sinó que també donava suport a la idea que aquest flavonoide podria ser útil per tractar diverses malalties inflamatòries del pulmó. L'asma és una malaltia al·lèrgica important de les vies respiratòries que seria susceptible de lliurament de pinocembrina als pulmons. S'ha demostrat l'evidència preliminar que recolza els efectes antiasmàtics de la pinocembrina en un estudi on les injeccions intraperitoneals de pinocembrina van inhibir la malaltia al·lèrgica de les vies respiratòries en ratolins [20]. Per tant, es podria esperar raonablement que el lliurament localitzat de pinocembrina només als pulmons seria més eficaç per tractar afeccions semblants a l'asma a la clínica.

Conclusió

En conclusió, les dades fortes i significatives derivades d'aquest estudi eren coherents amb que la pinocembrina era bioactiva i millorava els paràmetres clau de la malaltia en el model animal. Els sorprenents efectes de remodelació antiinflamatoris i antifibròtics modestos de l'administració de pinocembrina probablement estaven relacionats amb la seva capacitat per millorar la patologia pulmonar i el compliment funcional.