Mutacions UMOD en la malaltia renal crònica a Taiwan

Resum:UMODés el primer gen identificat i més freqüentment mutat que causa l'autosòmica dominantmalaltia renal tubulointersticial(ADTKD). Estudis recents han demostrat que ADTKD-UMODés una causa relativament freqüent demalaltia renal crònica(ERC). Tanmateix, l'estat d'ADTKD-UMODa Taiwan segueix sent desconegut. En aquest estudi, hem identificat tres heterozigotsUMODvariants missense, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) i c.817G > T (p.Val273Phe), en un total de 221 famílies d'ERC seleccionades (1,36%). Dues d'aquestes variants de missense, p.Cys41Arg i p.Gly60Asp, no s'han informat anteriorment. In vitro, els estudis van demostrar que ambdues variants d'uromodulina tenen defectes en el tràfic de la membrana cel·lular i l'excreció al medi de cultiu. El model d'estructura va predir la formació d'enllaços disulfur alterats en ambdues variants, però només es va predir que p.Gly60Asp provocaria la desestabilització de proteïnes. Les nostres troballes amplien l'espectre de mutació i indiquen que l'ADTKD-UMODva contribuir a una causa petita però significativa d'ERC a la població taiwanesa.

Paraules clau: uromodulina;malaltia renal crònica(ERC); tubulointersticial autosòmica dominantmalaltia de ronyó(ADTKD); insuficiència renal (KF).

FEU CLIC AQUÍ PER OBTENIR SUPLEMENTS D'HERBES DE CISTANCHE PER A LA MALALTIA RENOLÓ

1. Introducció

ADTKD és una malaltia hereditària dominant rara causada per mutacions heterozigotes en UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] i SEC61A1 [5]. UMOD és la primera causa identificada i la més comuna d'ADTKD, i ha estat objecte d'una àmplia investigació [1,6]. Encara que rar, ADTKD és el tercer monogènic més comúmalaltia de ronyódesprés de l'ADPKD i la nefropatia de col·lagen tipus IV, però la prevalença d'ADTKD-UMOD encara no està clara, i estudis recents mostren que representa fins al 2% dels pacients amb KF o 0,3% de tots els individus amb CKD [7, 8]. UMOD codifica uromodulina i és la proteïna més abundant a l'orina humana [9]. La uromodulina és una proteïna específica del ronyó produïda per les cèl·lules epitelials de l'extremitat ascendent gruixuda del bucle de Henle i la part primerenca del túbul contornejat distal [10], i es forma com un polímer d'alt pes molecular a través de la seva zona. domini pelúcida [11]. A més, l'uromodulina és una proteïna altament glicosilada, amb set llocs de N-glicosilació i escissió al final del C-terminal per la serina proteasa hepsina, abans d'excretar-se al lumen tubular [9,12,13]. La funció de l'uromodulina inclou la protecció contra la cristal·lització d'oxalat de calci [14], la defensa contra les infeccions del tracte urinari per bacteris uropatògens [15–18] i la regulació del canal iònic Ca2+-K+ [19]. L'efecte de les mutacions UMOD és el retard en la maduració, la retenció al reticle endoplasmàtic (ER), la reducció de l'expressió a la membrana plasmàtica i la disminució de l'excreció urinària, la qual cosa condueix a l'estrès ER i la resposta proteica desplegada [20–22].

Els fenotips clínics d'ADTKD-UMOD són inespecífics i inclouen CKD, gota, hiperuricèmia, proteïnúria normal a lleu, presència o manca d'antecedents familiars i la majoria dels individus afectats que entren en KF entre els 30 i els 50 anys [23]. La histologia renal mostra dilatació o atròfia tubular, cancel·lació o engrossiment de la membrana basal tubular, fibrosi intersticial i acumulació d'uromodulina mutada com a materials polimòrfics no estructurats revelats per la tinció de PAS [24,25].

Taiwan té la major incidència i prevalença de CKD i KF segons les comparacions internacionals de l'informe USRDS [26]. Tanmateix, cap estudi s'ha centrat en l'estat d'ADTKD-UMOD a la població de CKD a Taiwan. En aquest estudi, es va examinar la prevalença de mutacions ADTKD-UMOD en una cohort de CKD seleccionada en un únic centre terciari de Taiwan.

2. Materials i Mètodes

2.1. Individus ERC i Preparació d'ADN

Aquest estudi va reclutar 221 famílies de CKD (228 persones) del Programa d'atenció a la CKD de l'Hospital Universitari Mèdic de Kaohsiung. Els criteris d'inclusió incloïen episodis de gota o hiperuricèmia amb eGFR inferior a 90 ml/min/1,73 m2 abans dels 40 anys. Les mostres de sang, la informació genealògica i l'accés als resultats del treball de laboratori es van obtenir d'individus després de donar-se el consentiment informat. L'estudi es va dur a terme seguint la Declaració d'Hèlsinki i aprovat per la Junta de Revisió Institucional de KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024). L'ADN de mostres de sang perifèrica es va extreure segons el mètode estàndard.

2.2. Seqüenciació d'exomes i anàlisi bioinformàtica

El panell Nextera Flex for Enrichment and Exome (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, EUA) es va utilitzar per a la creació de biblioteques d'exomes. La selecció de la mida, la captura de seqüències, l'enriquiment i l'elució es van realitzar segons les instruccions del fabricant. A continuació, es va mesurar la distribució de la mida de les biblioteques d'ADN mitjançant TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA), seguida de la seqüenciació en un Illumina NovaSeq 6000 amb lectures aparellades de 150 pb. Les dades fastq resultants es van alinear a la seqüència del genoma humà de referència (GRCh37/hg19) i vam realitzar una trucada de variants de nucleòtids mitjançant la plataforma DRAGEN Bio-IT (Illumina). El fitxer VCF es va analitzar a CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, EUA). Les variants identificades es van etiquetar com a patògenes/probables patògenes, variant de significació incerta (VUS) o benignes, segons la classificació de l'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), utilitzant el programari VarSome, i vam comparar variants que existien al ClinVar. bases de dades , HGMD i dbSNP. Les variants patògenes detectades, probablement patògenes i VUS es van confirmar mitjançant la seqüenciació de Sanger. Per a la seqüenciació de Sanger, els productes de PCR es van purificar mitjançant tractament amb fosfatasa alcalina / exonucleasa I (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) i després es van sotmetre a seqüenciació des dels dos extrems mitjançant seqüenciació amb termociclador mitjançant la seqüenciació BigDye® 3.1 kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) després de l'anàlisi en un analitzador d'ADN ABI 3730XL (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). L'anàlisi de segregació es va realitzar si hi havia ADN disponible dels membres de la família. Els exons 2, 3, 4 i 5 d'UMOD es van examinar mitjançant la seqüenciació de Sanger a la provada de 221 famílies de CKD, excepte la família DY5, que va rebre la seqüenciació de l'exoma. La seqüència de referència NCBI NM_003361.4 s'utilitza per a UMOD. La nomenclatura estàndard recomanada per la Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; consultat el 18 de juliol de 2022.) es va utilitzar per numerar nucleòtids i anomenar mutacions o variants.

2.3. Cultiu cel·lular i transfecció transitòria

Les cèl·lules HEK293 (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, EUA) es van cultivar en la modificació de Kaighn del medi F-12 de Ham (F{-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, EUA) complementat amb sèrum boví fetal inactivat per calor al 10% (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), 100 unitats/mL de penicil·lina, 100 µg/mL d'estreptomicina (10378016, Gibco Scientific, Fisher ), i 10 unitats/ml -interferó (IF002, Merck/Millipore Sigma). Les cèl·lules es van mantenir a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada d'un 5% de CO2.

La transfecció transitòria de cèl·lules HEK293 es va realitzar mitjançant Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Breument, es van afegir 2,5 µL de Lipofectamine 2000 directament a 100 µL de medi Optimum (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) i es van incubar durant 5 min a temperatura ambient. Es va afegir un total d'1 µg d'ADN a la barreja de Lipofectamine 2000-Optimum i es va incubar durant 20 minuts més. La barreja d'ADN es va afegir a les plaques de cultiu cel·lular amb un medi sense sèrum gota a gota al final de la incubació. Per a l'estat de salut de les cèl·lules després de la transfecció transitòria, hem utilitzat el comptador de cèl·lules automatitzats LUNA-II ™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Corea) per detectar la viabilitat de les cèl·lules de tinció de blau tripà en un moment diferent, i la majoria les cèl·lules transfectades van romandre vives després d'una sobreexpressió d'uromodulina diferent (dades no mostrades).

2.4. Mutagènesi dirigida al lloc

El vector d'uromodulina de tipus salvatge marcat amb HA es va obtenir del Dr. Rampoldi [27]. Les construccions de mutació de p.Cys41Arg i p.Gly60Asp es van crear mitjançant el QuikChange II Site-Directed Mutagénesis Kit (200523, Agilent) segons les instruccions del fabricant. Les mutacions es van confirmar mitjançant la seqüenciació de Sanger

2.5. ELISA i fraccionament

El vector buit, la uromodulina de tipus salvatge, l'uromodulina p.Cys41Arg i les construccions d'expressió d'uromodulina p.Gly60Asp es van transfectar de manera transitòria a cèl·lules HEK293. Després de la transfecció transitòria, el medi de cultiu es va recollir a les 8, 24 i 32 h, després es va emmagatzemar a -80 ◦ C abans de la mesura. Per a la immunoblot, el medi de cultiu es va condensar mitjançant Centri con (YM3, icona, Merck/Millipore Sigma) abans de l'electroforesi SDS-PAGE. S'ha utilitzat ELISA per dur a terme mesures de l'uromodulina en el medi de cultiu segons les instruccions del fabricant (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Breument, el medi de cultiu i els estàndards es van diluir en un diluent d'assaig subministrat al kit i es van afegir als pous per duplicat. Després de 2,5 h d'incubació a temperatura ambient, es van rentar els pous amb PBS i es va afegir l'anticòs d'uromodulina biotinilada. Després d'1 h d'incubació a temperatura ambient, es van tornar a rentar els pous i es va afegir un anticòs secundari estreptavidina-peroxidasa de rave picant. Després de 45 min d'incubació a temperatura ambient, es van tornar a rentar els pous i es va desenvolupar el color afegint una solució de substrat TMB i incubant a la foscor a temperatura ambient durant 30 min. La reacció es va aturar afegint la solució d'aturada subministrada al kit, seguida de la lectura immediata a OD450 i OD550. La concentració d'uromodulina del medi de cultiu es va determinar per interpolació a la corba estàndard.

Després de recollir el medi de cultiu, les cèl·lules unides al plat de cultiu van procedir al fraccionament mitjançant un kit de fraccionament de proteïnes subcel·lulars (78840, Thermo Fisher Scientific) segons les instruccions del fabricant. En resum, vam recollir quantitats iguals de tres tipus diferents de lisat de cèl·lules d'uromodulina i vam eliminar tot el sobrenedant fins que el més sec possible. Vam afegir un tampó d'extracció citoplasmàtica freda amb gel que conté inhibidors de la proteasa al sediment cel·lular, es va incubar a 4 ◦ C durant 10 min amb una barreja suau i després es va centrifugar a 500 × g durant 5 min. Immediatament vam treure el sobrenedant (extracte citoplasmàtic) a un tub net prerefrigerat sobre gel i vam afegir un tampó d'extracció de membrana freda amb gel que conté inhibidors de la proteasa al pellet. La part de la membrana es va vortexar durant 5 s a la configuració més alta i es va incubar a 4 ◦ C durant 10 min amb una barreja suau. Vam transferir el sobrenedant (extracte de membrana) a un tub net prerefrigerat sobre gel després de centrifugar a 3000 × g durant 5 min. La membrana subcel·lular i la proteïna citoplasmàtica es van analitzar mitjançant western blot.

2.6. Anàlisi d'immunoblotting

Les mostres de proteïnes es van recollir de les cèl·lules amb un tampó RIPA (R0278, Merck/ Millipore Sigma) o el pas de fraccionament. Posteriorment, es va determinar la concentració de proteïnes mitjançant un colorant d'assaig de proteïnes (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, EUA) i l'accés a una quantitat igual de proteïnes, després separades per electroforesi a SDS-PAGE. Després de transferir les proteïnes a membranes de difluorur de polivinilidè (PVDF) (1620177, BIO-RAD), la membrana de PVDF es va submergir en llet desnatada al 5% a 1X TBST, bloquejant durant 1 h a temperatura ambient i rentada tres vegades amb 1X TBST per 5 min. A continuació, vam incubar la membrana de PVDF amb l'anticòs primari a 4 ◦ C durant la nit, la vam rentar tres vegades amb 1X TBST durant 5 min i la vam incubar amb l'anticòs secundari durant 1 h a temperatura ambient. Es va rentar tres vegades amb 1X TBST durant 5 minuts després de la incubació d'anticossos secundaris, després vam afegir el kit de substrat de quimioluminescència millorada (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) i vam detectar el senyal de proteïnes mitjançant un processador de raigs X (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, EUA) en pel·lícules de raigs X (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Els anticossos primaris i secundaris es van diluir amb llet desnatada al 5% en 1X TBST, i la informació detallada és la següent 1:2000 per a la uromodulina (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, EUA) i 1:20.000 per al conill. 2n anticòs HRP (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, EUA).

2.7. Predicció de l'estructura de proteïnes

La dinamita es va aplicar per a la predicció de l'estructura 3D de l'uromodulina de tipus salvatge i mutant (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; consultat el 15 de juny de 2022.) mitjançant l'estructura de longitud completa de l'uromodulina humana nativa (proteïna). Banc de dades: 7PFP) [28]. DiANNA es va utilitzar per a la predicció de l'enllaç disulfur (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; consultat el 16 de juny de 2022.) de la uromodulina mutant i de tipus salvatge [29–31].

2.8. Anàlisi estadística

El programari d'anàlisi ImageJ va analitzar i quantificar les bandes de western blot. Les anàlisis estadístiques i els gràfics es van realitzar i preparar mitjançant el programari GraphPad Prism8 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, EUA), i es va presentar la mitjana ± SEM. Es va aplicar una prova t no aparellada per a una comparació de dos grups. Els resultats estadístics es van marcar de la següent manera: * p < 0.05; ** p <0,01; *** p < 0,001. Cada experiment es va repetir almenys tres vegades.

Servei de suport:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp/Tel:+86 15292862950}

Botiga:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop